(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

病毒樣顆粒疫苗在豬病防控中的應(yīng)用研究進展

莊金秋，梅建國，李 峰，王 艷，沈志強

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

病毒樣顆粒（VLPs）疫苗因其免疫原性好、安全性好，已成為研制安全高效的預(yù)防人和動物病毒性疾病的潛在候選疫苗。通過綜述VLPs疫苗在豬病防控中的應(yīng)用研究進展，以期為獸醫(yī)科技工作者和廣大養(yǎng)殖業(yè)主更好地了解VLPs疫苗提供參考。

病毒樣顆粒；疫苗；豬??；防控；研究進展

病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）是由病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白自動組裝而成的空心顆粒，沒有病毒的核酸（DNA/RNA），不能自主復(fù)制，在形態(tài)上與天然病毒粒子相同或相似，俗稱偽病毒、假病毒[1]。VLPs不具有感染性，但具有很強的免疫原性，它可作為免疫原，通過和病毒感染機體一樣的途徑呈遞給免疫細胞（T、B淋巴細胞），進而有效地誘導(dǎo)機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)[2]。VLPs因其免疫原性好、安全性好，是研制安全高效的預(yù)防病毒病的潛在候選疫苗。迄今為止，國內(nèi)外針對人和動物的病毒性疾病，在市場上使用和臨床研發(fā)中的VLPs疫苗至少35種以上[3]。目前，市場上還未有針對畜牧業(yè)常見疾病的VLPs疫苗，但是已經(jīng)開始了相關(guān)課題的研究。

1 VLPs在豬病防控中的應(yīng)用研究

1.1 豬細小病毒病

豬細小病毒（PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，PPV感染主要引起胚胎和胎兒死亡、重吸收、流產(chǎn)、木乃伊胎等，但母豬不表現(xiàn)明顯的癥狀。VP2是構(gòu)成PPV病毒粒子的主要衣殼蛋白，也是中和抗體作用的主要靶蛋白，具有良好的免疫原性，在哺乳動物細胞內(nèi)或桿狀病毒表達系統(tǒng)進行VP2的體外表達，可以在體外自我裝配形成VLPs。另外，VP2蛋白可以作為一種抗原的轉(zhuǎn)運載體，攜帶外源表位，組裝成嵌合表位VLPs，嵌合表位VLPs免疫動物具有雙重的免疫效果。Martine等[4]（1992）將PPV VP2基因克隆到桿狀病毒系統(tǒng)中，并成功地在昆蟲細胞中高效表達，表明VP2多肽能夠自我裝配成VLPs，該研究為PPV新型亞單位疫苗的研究提供了新思路，而且PPV VLPs不僅自身可以作為疫苗，在外源多肽的轉(zhuǎn)運及多價疫苗的研制中也發(fā)揮重要作用。F.G.A. Adriaan等[5]（2006）用昆蟲細胞中表達的PPV VP2基因產(chǎn)物制備VLPs疫苗，在添加免疫佐劑的情況下，VLPs疫苗可在豬體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的血清抗體。

1.2 口蹄疫

董艷美等[6]（2013）選擇了口蹄疫病毒（FMDV）O/HLJOC12/03毒株的VP1蛋白上關(guān)鍵的抗原決定簇第141～160位氨基酸對應(yīng)的核苷酸序列，利用重疊延伸PCR（SOE-PCR）插入到MS2噬菌體的外殼蛋白基因的特定位點，經(jīng)過大腸桿菌誘導(dǎo)表達FMDV的抗原決定簇多肽表達展示在MS2表面的VLPs。結(jié)果證實該VLPs蛋白可以很好地誘導(dǎo)被免疫的小鼠產(chǎn)生特異的抗體，且具有很好的免疫原性。該研究為進一步開發(fā)出新型的FMD的VLPs疫苗提供了實驗依據(jù)。董虎等[7]（2014）將FLAG序列通過融合PCR技術(shù)插入FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1 GH-loop可變區(qū)，并通過大腸桿菌原核表達技術(shù)表達FMDV衣殼蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1，在體外組裝出嵌合FLAG外源多肽的VLPs，以期為研究制備多聯(lián)或多價FMDV的VLPs疫苗奠定基礎(chǔ)。潘群興等[8]（2010）為增強表位疫苗的免疫原性，為了研制開發(fā)免疫原性更好、成本低的新型疫苗，以PPV VP2病毒樣顆粒作為外源免疫原性多肽的分子載體，利用桿狀病毒表達載體系統(tǒng)表達了O型FMDV VP1中T細胞表位肽嵌合的PPV VP2病毒樣顆粒[rPPV：VLP（FMDV）]。潘群興等[9]（2013）進一步研究表明，該嵌合FMDV T抗原表位PPV VP2表達蛋白構(gòu)成的細小病毒樣顆粒，在無免疫佐劑存在的情況下免疫小鼠后，在低濃度FMDV抗原下能夠產(chǎn)生特異性T淋巴細胞增殖反應(yīng)，表明嵌合VLPs具有良好的免疫原性，這為在豬體進行該VLPs的免疫研究以及不需要佐劑的顆?；呙绲难兄铺峁┝藢嶒炓罁?jù)，也為PPV、FMDV二聯(lián)因工程疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

1.3 豬偽狂犬病

國內(nèi)外諸多學(xué)者已應(yīng)用桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達出PPV的VP2蛋白及其自我裝配成的VLPs，但應(yīng)用偽狂犬病病毒（PRV）表達系統(tǒng)表達PPV的VP2蛋白及其自我裝配成的VLPs還鮮見報道。陳楊等[10]（2011）成功實現(xiàn)了利用PRV載體表達PPV的VP2蛋白的VLPs，通過IFA檢測了VP2基因在PRV中的表達，并通過電鏡觀察到了VP2基因表達產(chǎn)物可自我裝配成VLPs，且在1個細胞中可以同時觀察到PRV與PPV兩種VLPs，實現(xiàn)了利用PRV表達系統(tǒng)表達PPV的VP2蛋白的VLPs。若進一步研究表明PRV SA215/VP2株可作為疫苗株，則通過培養(yǎng)PRV SA215/VP2就可以直接生產(chǎn)出PRV-PPV二聯(lián)疫苗，不需要滅活或分離PRV，并起到“一免多防”的功效，在生產(chǎn)成本方面也將極具優(yōu)勢。

1.4 豬瘟

豬瘟病毒（CSFV）是引起豬瘟的病原，相應(yīng)于其非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3的1446～1460氨基酸殘基的多肽E290，含有CSFV特異的輔助性T細胞表位和CTL細胞表位，在體液免疫和細胞免疫中均具有重要作用，為CSFV的免疫優(yōu)勢T細胞抗原表位。范京惠等[11]（2007）將PPV的VP2基因克隆至真核表達載體pMel BacA 的XhoⅠ和KpnⅠ之間的多克隆位點，并在VP2基因的5'端插入CSFV的T細胞表位基因E290，在成功構(gòu)建了重組子pMVP2-E290陽性質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，將其與Bac-N-Blue DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞sf9，形成的重組桿狀病毒在體外表達后，表達蛋白具有天然蛋白的生物學(xué)特性，且通過自我組裝后形成的VLPs，在無免疫佐劑的情況下免疫小鼠，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了高效價的抗PPV抗體及CSFV特異的CTL反應(yīng)，而且產(chǎn)生的抗PPV抗體效價顯著高于滅活疫苗免疫組。這為在豬體進行此VLPs的免疫研究以及不需要佐劑的顆?；呙绲难兄铺峁┝嘶A(chǔ)資料。徐義剛等[12]（2007）用乳酸菌表達CSFV特異性的CTL表位E 290和PPV的VP2，口腔免疫豬，結(jié)果表明在沒有佐劑的條件下，重組的乳酸菌可以誘導(dǎo)強烈的黏膜免疫及CSFV特異性的CD8+型的CTL反應(yīng)，可以抵抗致死劑量的CSFV的攻擊。

1.5 豬乙型腦炎

豬乙型腦炎是日本腦炎病毒（JEV）引起的人畜共患傳染病。JEV E蛋白結(jié)構(gòu)域III（EDIII）是誘導(dǎo)中和抗體的重要區(qū)域，EDIII的一個環(huán)肽（loop3）能通過干擾病毒吸附細胞抑制病毒感染。乙肝核心蛋白（HBC）是乙肝病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，它在細菌、真核細胞以及哺乳動物細胞內(nèi)均能被高效表達并自動裝配成VLPs，是一種良好的表位展示免疫載體。而且在HBC特定位置插入的外源短肽序列不會影響HBC的構(gòu)象及自我組裝，同時插入的外源短肽能以多次重復(fù)的方式被展現(xiàn)在VLPs表面，從而能大大提高表位肽的免疫原性。李朋[13]（2013）首先構(gòu)建了以HBC為載體的重組融合表達質(zhì)粒pET28a-HBC-loop3，在HBC的MIR區(qū)插入JEV EDIII loop3表位基因。結(jié)果證明了該VLPs抗原具有良好的免疫原性。PPV和JEV均是引起母豬繁殖障礙的主要病原。為了有效預(yù)防這2種病原引起的疫病，蔣春英[14]（2013）把JEV E蛋白上4個B細胞表位及2個T細胞表位基因與PPV結(jié)構(gòu)蛋白基因VP2串聯(lián)起來，構(gòu)建成VLPs [PPV：VLP（JEV）]，并在細菌中高效表達。重組蛋白純化后，體外組裝成VLPs后免疫小鼠研究其免疫原性。結(jié)果表明展示JEV多B細胞表位和T細胞表位的PPV VLPs能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異性的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而為研究安全有效的JEV和PPV二聯(lián)基因工程疫苗提供了新的思路和方法。在目前應(yīng)用的一些弱毒疫苗和滅活疫苗存在缺陷和不足的情況下，該嵌合VLPs具有較大的潛在價值。

1.6 豬圓環(huán)病毒病

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）為代表的系列疾病的病原，主要侵害6～12周齡的仔豬。PCV2的感染呈世界性分布，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要

病因之一。尹雙輝[15]（2011）首次利用E.coli表達的重組蛋白在體外制備Cap蛋白VLPs，為研制PCV2 VLPs疫苗奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果證明體外制備的PCV2 Cap VLPs疫苗有確實的刺激機體體液免疫和細胞免疫反應(yīng)的能力。李玲等[16]（2011）應(yīng)用Bac-to-Bac桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)，獲得PCV2b的重組桿狀病毒。將該重組桿狀病毒感染HighFiveTM細胞后，VLPs在培養(yǎng)上清中的大量存在，為目的蛋白的分離和純化提供了便利，也為PCV2基因工程疫苗的產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。PPV不僅可引發(fā)嚴重的繁殖障礙性疾病，導(dǎo)致胚胎和胎兒死亡；而且能同PCV2混合感染，在PMWS感染中發(fā)揮著重要作用。Pan等[17]（2008）運用PPV VP2 VLPs作為表位展示載體，在VP2的N端插入PCV2主要T細胞抗原表位，轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，在腺病毒表達載體中成功表達出嵌合VLPs［PPV：VLP（PCV2）］；將該帶有PCV2抗原表位的PPV顆粒在無免疫佐劑參與的情況下免疫小鼠，嵌合的VLPs不僅能誘導(dǎo)小鼠機體產(chǎn)生PCV2特異性的CTL反應(yīng)，還能刺激小鼠產(chǎn)生高效價的PPV特異性抗體。朱玲等[18]（2010）選擇PPV VP2蛋白的2個位點插入PCV2 ORF2蛋白，構(gòu)建2個不同的重組體，結(jié)果獲得期望中的具有良好免疫原性的[PPV VP2：PCV2 ORF2]重組VLPs，同時也揭示PPV VPLs的N端1/3適于外源蛋白插入構(gòu)建重組VLPs。

1.7 豬藍耳病

李楊[19]（2012）利用桿狀病毒表達系統(tǒng)高效表達了PRRSV GP2b、GP5、M和N蛋白，并證實共表達GP5和M蛋白可組裝成VLPs，而GP2b有助于VLPs的釋放。

1.8 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種以嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床癥狀的高度傳染性疾病，尤其對2周齡以內(nèi)的仔豬具有很高的致死率，死亡率可達100%。該病呈世界性分布，給各國養(yǎng)豬業(yè)均造成了嚴重的經(jīng)濟損失。Baudoux等[20]（1998）研究表明，體外共表達TGEV的M、sM蛋白可形成VLPs，且病毒粒子被釋放到細胞培養(yǎng)液中。M蛋白與sM蛋白形成的VLPs能夠誘導(dǎo)IFN-α的產(chǎn)生，具有防御TGEV的感染的作用。冷勇等（2013）[21]、宋振輝等[22]（2014）研究利用家蠶Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了TGEV的M蛋白、sM蛋白和N蛋白的重組桿狀病毒，VLPs的體外組裝試驗表明在sf9細胞內(nèi)M蛋白單獨表達，M蛋白和sM蛋白共表達，M蛋白和N蛋白共表達，都可形成VLPs，且VLPs大小不等。這為進一步研究TGEV的裝配提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)實驗材料。

2 存在的問題與展望

VLPs疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，其具有強大的免疫優(yōu)勢：表面結(jié)構(gòu)規(guī)則，大小合適，不含核酸，不能自主復(fù)制，不具有傳染性，易于被免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生很好的免疫效果；在血清中的半衰期較長；質(zhì)量穩(wěn)定、安全可靠等等。這極大地吸引了眾多疫苗研發(fā)者的目光。VLPs作為免疫原與病毒顆粒一樣，在沒有佐劑的情況下，低劑量也能激起高效的免疫反應(yīng)，這將有利于打破腫瘤和病毒慢性感染所產(chǎn)生的免疫耐受，使VLPs展示表位疫苗具備直接用于治療的特性。因此，VLPs作為一種新型疫苗，不僅克服了傳統(tǒng)疫苗的不足，而且也彌補了基因疫苗的缺憾，是目前最有發(fā)展前景的預(yù)防兼治療的候選疫苗，在腫瘤、傳染病、過敏性疾病的預(yù)防和治療上展現(xiàn)了廣闊的前景，為科學(xué)研究開辟了新的探索領(lǐng)域。然而VLPs作為預(yù)防性疫苗還有很多問題需要探索。如表達系統(tǒng)的選擇、VLPs組裝效率的提高以及病毒變異帶來的免疫逃避；建立多基因共表達載體的難度大，各個基因表達量的比例難以控制；VLPs作為疫苗多是幾種型特異性多價疫苗，而多價苗之間的量效關(guān)系確定較為復(fù)雜；有的VLPs必需在添加佐劑后才能達到免疫效果，而佐劑和VLPs的劑量比例關(guān)系需要進一步驗證；VLPs作為疫苗的最佳免疫途徑、劑量和保護作用的確切評價還無定論；VLPs疫苗的免疫效果與全病毒疫苗（滅活苗或弱毒苗）接近，但在交叉免疫方面仍然存在缺陷等等。雖然VLPs疫苗存在諸多不足，但是基于VLPs構(gòu)建多價或嵌合疫苗具有廣闊的前景，相信隨著以上問題的逐步解決，更多VLPs疫苗的成功問世指日可待。

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2015-02-03）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-022-15）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，獸醫(yī)碩士，副研究員，主要從事細胞培養(yǎng)和動物用病毒疫苗研制