屈碧輝 蔡 威 何 濤 胡 敏 王迪樂 (武漢市中心醫(yī)院血管外科，湖北 武漢 43004)

腹主動脈瘤(AAA)是一種常見的炎性血管疾病〔1〕。AAA炎癥的特點(diǎn)是主動脈壁多種白細(xì)胞的浸潤，包括淋巴細(xì)胞〔2〕。文獻(xiàn)報道干擾素(IFN)-γ在AAA患者血液和腫瘤組織中的表達(dá)均出現(xiàn)顯著的增加〔3～5〕。同時，CD4 T細(xì)胞和IFN-γ與 AAA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔6〕。這些研究表明，AAA患者的免疫處功能是處于失衡狀態(tài)的，據(jù)此導(dǎo)致CD4 T細(xì)胞的異常增殖和分泌更多的IFN-γ，從而導(dǎo)致腹主動脈擴(kuò)張相關(guān)的自身免疫損傷過程。調(diào)節(jié)性細(xì)胞在維持機(jī)體免疫狀態(tài)平衡中具有重要的作用。除外常見的CD4調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)外，還有一群B細(xì)胞，主要細(xì)胞表型為CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞，也具有抑制CD4 T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力，CD19+CD24hiCD38hiB的這種免疫抑制功能主要是通過分泌均細(xì)胞介素(IL)-10而實(shí)現(xiàn)的〔7〕。CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能異常在其他疾病中已有報道〔8〕，而關(guān)于 CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞在AAA發(fā)病中的作用還未見文獻(xiàn)報道。本研究觀察了AAA患者外周血 CD4 T細(xì)胞及CD19+CD24hiCD38hiB調(diào)節(jié)性 B細(xì)胞(Breg)比例及功能的變化情況，期望為AAA發(fā)病機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集2012年5月至2014年8月?lián)衿谑中g(shù)的AAA患者40例及同期入院進(jìn)行健康體檢者40例。AAA組患者中，男33 例，女 7 例，平均年齡(59.65±8.28)歲，排除自身免疫性疾病、嚴(yán)重心肝腎功能不全和血液系統(tǒng)疾病等。所有患者均經(jīng)CT或磁共振成像(MRI)檢查確診為AAA。健康對照組中，男32 例，女8 例，平均年齡(59.78±9.49)歲。

1.2外周血單個核細(xì)胞(PBMC)分離方法 靜脈取血，加入含肝素溶液的試管中，混勻，使血液抗凝。抗凝血以無菌RPMI 1640培養(yǎng)基按1∶1的比例進(jìn)行稀釋，按稀釋血液和淋巴細(xì)胞分離液2∶1的比例，將預(yù)加淋巴細(xì)胞分離液離心管傾斜45°角，用滴管將稀釋的血液緩緩沿管壁緩慢加至分離液上面，應(yīng)注意保持兩者界面清晰，800 r/min離心18 min;滴管輕輕吸取中間的白膜層，加入裝有RPMI 1640培養(yǎng)基的移入另一支離心管中，600 r/min離心15 min;細(xì)胞沉淀以適量 RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，400 r/min離心8 min;臺盼藍(lán)染色計數(shù)后制備成合適濃度的細(xì)胞懸液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3表面分子流式細(xì)胞染色 上述分離獲取的PBMC以流式細(xì)胞染色洗液洗滌2次后，加入CD4、CD19、CD24和CD38熒光抗體，4℃冰箱中孵育30 min;以流式細(xì)胞染色洗液洗滌2次后，細(xì)胞重懸于磷酸鹽緩沖液(PBS)中立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.4胞內(nèi)分子流式細(xì)胞染色 上述分離獲取的PBMC中加入Activation Cocktail(含有高爾基體阻斷劑)，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h;收集細(xì)胞，按上述方法進(jìn)行表面分子CD4流式細(xì)胞染色，隨后加入0.5 ml細(xì)胞膜固定透化液，室溫避光孵育30 min;以透化液洗滌細(xì)胞2次后加入IFN-γ抗體，室溫避光孵育30 min;以透化液洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞重懸于0.2 ml PBS中立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞抑制CD4 T細(xì)胞IFN-γ分泌能力檢測時，將兩種細(xì)胞按1∶1比例加入于1 μg/ml CD3抗體及2 μg/ml CD28抗體包被的96孔板中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中共孵育72 h，隨后按上述步驟進(jìn)行檢測。

1.5CFSE細(xì)胞增殖檢測 上述分離獲取的PBMC經(jīng)磁珠分選(按說明書進(jìn)行操作)獲取Na?ve CD4 T及經(jīng)流式細(xì)胞儀分選獲取CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞。Na?ve CD4 T以10 ml的 RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌1次，以1 ml的RPMI-1640重懸，按10 μl/1×107個細(xì)胞加入CFSE染液，混勻后于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育15 min，隨后立即在細(xì)胞中加入5 ml預(yù)冷的含5%PBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行終止染色，隨后冰上放置5 min，離心8 min，再以10 ml的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌1次，細(xì)胞以含10%FBS的 RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸后，加入1 μg/ml CD3抗體及2 μg/ml CD 28抗體包被的96孔板中，孵育5 d后收取細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞抑制Na?ve CD4 T細(xì)胞增殖能力檢測時，將兩種細(xì)胞按1∶1比例加入于1 μg/ml CD3抗體及2 μg/ml CD28抗體包被的96孔板中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中共孵育5 d，隨后按上述步驟進(jìn)行檢測。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1外周血CD4 T細(xì)胞比例變化情況 AAA患者外周血CD4 T細(xì)胞比例〔(56.9±5.9)%〕高于健康對照外周血 CD4 T細(xì)胞比例(44.6±6.2)%(P＜0.05)。

2.2CD4 T細(xì)胞IFN-γ分泌情況 AAA患者外周血IFN-γ+CD4 T 細(xì)胞比例〔(46.5±5.28)%〕(P＜0.05)。

2.3CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞比例變化情況 AAA患者外周血 CD19+CD24hiCD38hiB 細(xì)胞比例為(1.01±0.13)%，健康對照組外周血CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞比例為(1.17±0.14)%，二者相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞抑制CD4 T細(xì)胞增殖能力檢測健康對照外周血單獨(dú)Na?ve CD4 T細(xì)胞的增殖能力為(84.9±5.12)%，Na?ve CD4 T 細(xì)胞與 CD19+CD24hiCD38hiB 細(xì)胞共培養(yǎng)后，Na?ve CD4 T 細(xì)胞的增殖能力為(51.8±3.99)%，提示，健康對照外周血CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞可顯著抑制外周血Na?ve CD4 T細(xì)胞的增殖能力(P＜0.01);AAA 患者外周血單獨(dú)Na?ve CD4 T 細(xì)胞的增殖能力為(86.5±4.94)%，Na?ve CD4 T細(xì)胞與CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞共培養(yǎng)后，Na?ve CD4 T細(xì)胞的增殖能力為(80.6±5.83)%，提示，AAA患者外周血 CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞抑制外周血Na?ve CD4 T細(xì)胞增殖的能力顯著降低(P＞0.05)。

2.5CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞抑制CD4 T細(xì)胞IFN-γ分泌能力檢測 健康對照患者外周血IFN-γ+CD4 T細(xì)胞比例在與CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞共孵育后從(24.9±5.02)%下降至(8.89±3.03)%(P＜0.01)。

3討論

AAA是指腹主動脈呈瘤樣擴(kuò)張，通常直徑增大50%以上定義為動脈瘤。AAA的發(fā)病機(jī)制涉及環(huán)境、遺傳、生物化學(xué)等多種因素。慢性炎癥細(xì)胞浸潤是AAA的典型特征。Xiong等〔6〕證實(shí)，CD4缺陷小鼠可抵抗AAA的形成提示CD4 T細(xì)胞可促進(jìn)AAA的發(fā)生和發(fā)展。CD4 T可分泌大量的炎性細(xì)胞因子，如 IFN-γ 和 TNF-α〔9～12〕。文獻(xiàn)報道，IFN-γ 在 AAA 患者血液和腫瘤組織中的表達(dá)均出現(xiàn)顯著的增加〔3～5〕，提示CD4 T細(xì)胞及其IFN-γ分泌能力的異?？赡軙?dǎo)致AAA的發(fā)生和發(fā)展。結(jié)合文獻(xiàn)報道結(jié)果，提示比例異常升高的CD4 T細(xì)胞可分泌大量的IFN-γ，從而參與AAA的發(fā)病。

目前，CD4 Treg細(xì)胞在AAA形成中的作用已得到肯定。而關(guān)于CD19+CD24hiCD38hi調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在AAA發(fā)病中的作用還未見文獻(xiàn)報道。因此，根據(jù)CD4 Treg在AAA中功能是存在異常的，可推論CD19+CD24hiCD38hi調(diào)節(jié)性B細(xì)胞功能在AAA亦可能存在異常，這兩種調(diào)節(jié)性細(xì)胞功能的異常均參與了CD4 T細(xì)胞功能異常的調(diào)控，最終導(dǎo)致腹主動脈擴(kuò)張相關(guān)的自身免疫損傷過程。本研究提示，CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞功能的異常參與了AAA的發(fā)生和發(fā)展。為AAA發(fā)病機(jī)制的研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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