趙文龍 ，文鵬程，趙 鵬，楊秀環(huán)，程柏叢，陳 余，何 誠

鏈格孢霉（Alternaria alternata）是污染食物和飼料真菌之一，廣泛分布于泥土和植物里,包括谷物、蔬菜、水果以及田間作物。1984 年對河南省8 個縣的糧食真菌做了分離培養(yǎng)，鏈格孢霉的檢出率高達82.2%，并且食管癌高發(fā)區(qū)與低發(fā)區(qū)有非常顯著性差異[1]。鏈格孢霉對動植物的毒性作用已有報道，如20 世紀(jì)40 年代俄國曾發(fā)生發(fā)霉谷物引起的中毒事件，從食用發(fā)霉谷物里分離出多種鏈格孢霉。用從煙草里分離出的長柄鏈格孢（Alternaria longipes）的產(chǎn)毒培養(yǎng)物喂飼雛雞，結(jié)果出現(xiàn)食欲不振、昏睡、腹瀉、肌無力和昏迷，4～8 d 出現(xiàn)死亡，培養(yǎng)物導(dǎo)致33%的雛雞死亡，存活雞只發(fā)育嚴(yán)重遲緩。病理檢查發(fā)現(xiàn)肌胃出血和潰瘍[1]。鏈格孢霉污染谷物喂飼雛雞，3 d 后出現(xiàn)腹瀉、行動遲緩以及出血癥候群引起的衰竭直至死亡，第4 天全部死亡[2]。此外，青霉菌也是主要谷物飼料產(chǎn)毒真菌之一，可產(chǎn)生青霉酸、桔青霉素，動物吃了污染飼料會因其產(chǎn)生大量的毒素對動物機體造成危害[3]。

北京某乳鴿場2013 年11 月至2014 年4 月，4 000 對肉種鴿出現(xiàn)持續(xù)性腹瀉和呼吸困難，種鴿死亡率不足10%。15～23 日齡的乳鴿呈現(xiàn)張嘴喘式呼吸，發(fā)病率為80%～100%，累計死亡率高達90%。剖檢見發(fā)病乳鴿、種鴿胸部、腹部氣囊出現(xiàn)大量干酪樣滲出物，肺臟、胰腺出現(xiàn)大量白色突起結(jié)節(jié)。

為了查清種鴿場的發(fā)病原因，分別取發(fā)病乳鴿、種鴿的肺臟組織進行了真菌和細(xì)菌培養(yǎng)。同時，取乳鴿主要飼料原料-玉米進行真菌培養(yǎng)。對培養(yǎng)的細(xì)菌和真菌進行鑒別，利用培養(yǎng)獲得的真菌培養(yǎng)物分別通過口服途徑接種9 日齡和25日齡健康A(chǔ)A肉雞，進一步復(fù)制臨床病理變化。同時，對種鴿場飼料原料、免疫程序進行調(diào)整，探討防治種鴿高死亡病癥的效果。

1 材料

1.1 動物與飼料 25 日齡乳鴿和325 日齡種鴿，來自北京懷柔縣某發(fā)病的種鴿場；9 日齡、25 日齡AA肉雞和雛雞飼料，購自北京華都肉雞公司。

1.2 設(shè)備 TDL5000B型低速冷凍多管離心機，上海安寧科學(xué)儀器廠；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 培養(yǎng)基 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基和血液培養(yǎng)基，批號：20081006，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 剖檢和分離培養(yǎng) 25 日齡死亡乳鴿10 只，325日齡發(fā)病種鴿5 只，進行剖檢。重點檢查呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的病理學(xué)變化。同時，無菌取乳鴿、種鴿肺臟組織、肝臟組織接種馬丁瓊脂培養(yǎng)基和血液培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～72 h。

2.2 飼料前處理和培養(yǎng) 定量稱取乳鴿發(fā)病期間使用玉米1 g，玉米破碎后加入30 mL 75%酒精浸泡1 h，1 000 r/min 離心10 min，取玉米沉渣放置在無菌培養(yǎng)皿中，加入改良馬丁瓊脂20 mL，25 ℃培養(yǎng)24～72 h 后，觀察真菌生長特點。

2.3 細(xì)菌和真菌的鑒定 取改良馬丁瓊脂平板上典型的真菌菌絲，放置在載玻片上，滴加1 滴1%氫氧化鈉溶液進行涂片，在顯微鏡下鏡檢。此外，選取血液培養(yǎng)基上的典型單個白色菌落送中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌室進行鑒定。鑒定后的典型菌落提取DNA，以16SrRNA為引物進行擴增，PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)入質(zhì)粒后進行測序[4]。

2.4 動物回歸試驗 9 日齡肉雞接種試驗：將72 h 的2 種特征性的菌絲（Ⅰ型和Ⅱ型）用1 mL 的無菌生理鹽水沖洗，再用生理鹽水進行稀釋至含有1×108個分生孢子/mL。將9 日齡20 只健康肉雞分成4 組：A組5 只，喉頭接種真菌培養(yǎng)物Ⅰ型；B組5 只，喉頭接種真菌培養(yǎng)物Ⅱ型；C組5 只，喉頭同時接種真菌培養(yǎng)Ⅰ、Ⅱ型；對照組5 只，接種等量的生理鹽水。接種后，每天對雞群進行臨床觀察，連續(xù)觀察10 d。死亡的雞進行剖檢記錄。

25 日齡肉雞接種試驗：將真菌培養(yǎng)物Ⅰ型喉頭接種5 只25 日齡肉雞，對照組接種同等劑量的生理鹽水，接種后觀察同上。

2.5 綜合防治措施 針對乳鴿飼料霉變問題，徹底更換無霉變的玉米。同時，對收購的玉米進行批次檢驗，拒絕收購霉變飼料；在鴿子飲水中添加好利高（10%牛至油），劑量為每1 000 只乳鴿添加250 mL，種鴿添加500 mL，連續(xù)10 d。對于大群中持續(xù)性呼吸困難的種鴿260 對，實施撲殺和無害化處理；針對乳鴿新城疫免疫程序進行了調(diào)整：在14 d 和25 d 進行滴鼻點眼新城疫弱毒疫苗，劑量為0.025 mL/只，免疫后按照每30 天進行定期監(jiān)測抗體變化。

3 結(jié)果

3.1 發(fā)病乳鴿和種鴿的剖檢變化 乳鴿病變主要集中在肺臟、氣囊、胰臟和肝臟上。肺臟出現(xiàn)灰白色結(jié)節(jié)樣增生物，直徑2～6 mm 不等（見中插彩版圖1）。胸部氣囊附著有大量的白色滲出物，或黃色干酪樣滲出物。胰腺表面也出現(xiàn)大小不等的灰白色結(jié)節(jié)物（見中插彩版圖2）。個別的肝臟表面出現(xiàn)小米粒樣大小的白色結(jié)節(jié)。

種鴿：肺臟和胰腺組織上附著大量的白色結(jié)節(jié)物（見中插彩版圖1-2）。胸氣囊和腹部氣囊附著大量的干酪樣滲出物。腎臟普遍腫脹，但肝臟病變不顯著。

3.2 鴿子病料和玉米分離培養(yǎng)結(jié)果 從發(fā)病乳鴿肺臟和玉米分離均獲得2 種典型的真菌菌落。

菌落Ⅰ：48 h 菌落呈羊毛至絨毛狀。72 h 菌落呈綠褐色或深褐色,背面呈黑色（見中插彩版圖3）。顯微鏡下分生孢子梗深色,直立,長短不一,不分支,頂端單生或串生呈淡褐色至深褐色,磚隔狀的分生孢子。分生孢子呈倒棍棒形、橢圓形或卵圓形,頂端有喙細(xì)胞（見中插彩版圖4）。經(jīng)過形態(tài)比對和文獻檢索，見中插彩版圖4 中的真菌屬于鏈格孢霉，又稱黑霉菌[5]。

菌落Ⅱ：菌落生長較快，呈現(xiàn)白色絮狀（見中插彩版圖5）。分生孢子梗有橫隔，光滑，基部無足細(xì)胞，分生孢子呈典型的掃帚狀（見中插彩版圖6）。

細(xì)菌分離培養(yǎng)：乳鴿肺臟和肝臟組織在血液培養(yǎng)基上同時培養(yǎng)出白色細(xì)小菌落，麥康凱培養(yǎng)基上出現(xiàn)白色小菌落。革蘭染色為陰性、大小均一的短桿菌（見中插彩版圖7）。以16SrRNA為引物進行擴增，其PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)入質(zhì)粒后進行測序，與傷寒沙門菌參考菌株08-1736（accession#CP006602.1）和參考株798（accession#CP003386.1）的相似性均為99.0%。

3.3 動物回歸試驗 9 日齡肉雞攻毒2 d 后，采食下降、精神委靡、呼吸困難（見中插彩版圖8），3 d后，A組死亡4 只。B組接種后采集食物正常，無臨床和無死亡發(fā)生。C組死亡3 只，臨床表現(xiàn)與A組相同。對上述死亡的雛雞進行剖檢發(fā)現(xiàn)：氣囊渾濁，肺臟呈現(xiàn)局灶性的出血，肺臟表面附著白色的結(jié)節(jié)，支氣管出血，腹氣囊上也見少量的白色結(jié)節(jié)（見中插彩版圖9）。從肺臟中也分離出鏈格孢霉和青霉菌。

25 日齡肉雞：接種后3 天，呈現(xiàn)喘式呼吸癥狀，未見有死亡。第7 天剖檢后，胸氣囊附著大量的白色滲出物，肺臟表面也出現(xiàn)白色的結(jié)節(jié)物。培養(yǎng)后分離出典型的鏈格孢霉。

3.4 采取綜合措施后的防治效果 徹底更換霉變的玉米，飲水中添加好利高（10%牛至油）和硫酸銅溶液（0.05%），連續(xù)10 d。此外，難以治愈的種鴿堅決淘汰，種鴿群發(fā)病率顯著下降，乳鴿發(fā)病率和死亡率控制在10%，出欄乳鴿的存活率達到92%，出欄體重也達到了上市的要求。

4 討論

4.1 鏈格孢霉和青霉菌在乳鴿高死亡率發(fā)病中作用探討 本試驗中從發(fā)病鴿子肺臟和飼料中分離獲得的鏈格孢霉和青霉菌，隨后在肉雞發(fā)病試驗中，發(fā)現(xiàn)鏈格孢霉單獨感染組、鏈格孢霉與青霉菌混合感染組均復(fù)制出了相似的臨床呼吸困難癥狀和病理學(xué)變化。從肺臟病變中分離獲得了鏈格孢霉和青霉菌。但是，青霉菌單獨接種后肉雞未出現(xiàn)死亡和典型的肺臟結(jié)節(jié)性病變。這顯示鏈格孢霉是主要的致病性真菌，青霉菌屬于條件性致病菌。鏈格孢霉污染可能在乳鴿頑固性肺炎和高死亡率中發(fā)揮主要作用。

本次乳鴿真菌病與以往報道煙曲霉感染蛋雞的報道有所區(qū)別[6]。本次發(fā)病主要侵害氣囊、肺臟、胰腺組織，其次是腎臟組織。而煙曲霉感染家禽后不但侵害肺臟、氣囊、腎臟，而且侵害肝臟組織，造成肝硬化。但是鏈格孢霉和煙曲霉均能引起持續(xù)性發(fā)作性的呼吸困難和死亡。以往鏈格孢霉感染雛雞死亡率達到33%，本次乳鴿的死亡率高達90%。肉雞回歸試驗中死亡率達到80%，這說明鏈格孢霉造成的危害性大于煙曲霉的感染。煙曲霉感染主要侵害10 日齡左右的雛雞，大于20 日齡的雛雞發(fā)病率降低。本次鏈格孢霉感染25 日齡回歸試驗，復(fù)制出了臨床呼吸道病癥狀，未見有死亡出現(xiàn)，這可能與觀察時間短有關(guān)。但是本次發(fā)病種鴿出現(xiàn)10%的死亡，這也說明鏈格孢霉具有較高的致病性。Christensen 等用從食物和飼料里分離到的鏈格孢霉、曲霉、青霉和鐮刀菌的培養(yǎng)物喂飼大鼠，鏈格孢霉、鐮刀菌、曲霉菌、青霉菌的培養(yǎng)物造成死亡率分別為78%、61%、43%和7%[7]。這說明鏈格孢霉污染飼料造成的損失超過曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌。此外，本次乳鴿肺臟和肝臟組織中均分離出傷寒沙門菌，懷疑病鴿霉菌感染后機體抵抗力下降，產(chǎn)生免疫抑制，繼發(fā)了沙門菌病的進一步感染[8]。

4.2 乳鴿鏈格孢霉感染的主要原因 據(jù)美國1984 年的谷物污染調(diào)查，230 份麥類樣品中，鏈格孢霉侵染率達77%，268 株鏈格孢霉菌株中有101株產(chǎn)毒素，鏈格孢霉主要通過污染小麥，造成肌胃潰瘍和腹瀉[1]。但是玉米中污染鏈格孢霉造成家禽的發(fā)病尚未見報道。本次從乳鴿、種鴿的飼料原料玉米中分離獲得了鏈格孢霉和青霉菌，且現(xiàn)場檢查40%～50%玉米的胚芽出現(xiàn)褐色斑塊。種鴿通過哺乳喂養(yǎng)給乳鴿，鏈格孢霉隨鴿乳進入幼鴿消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)，導(dǎo)致氣囊和肺臟感染。種鴿感染鏈格孢霉后，通過產(chǎn)生毒素，引起氣囊、肺臟滲出性炎癥，形成氣囊纖維素性病變和結(jié)節(jié)性病變，由于呼吸性衰竭而被迫淘汰。

4.3 鏈格孢霉病防治的措施分析 定期對飼料原料進行真菌培養(yǎng)和分析，杜絕發(fā)霉飼料用于乳鴿和種鴿飼養(yǎng)。其次，采取人工鴿乳方式對乳鴿進行哺育，切斷種鴿真菌病和沙門菌病向乳鴿傳播，減少發(fā)病的風(fēng)險。同時，針對種鴿沙門菌感染問題，采取定期檢測和診斷，淘汰陽性種鴿群，杜絕垂直傳播，保證乳鴿食品衛(wèi)生安全。

5 結(jié)論

通過病原分離、鑒定和動物回歸試驗證明鏈格孢霉感染可以造成乳鴿、種鴿結(jié)節(jié)性肺炎和乳鴿的高死亡率。玉米飼料污染大量的鏈格孢霉是發(fā)病的主要因素，養(yǎng)殖企業(yè)也要高度重視鏈格孢霉污染飼料后的危害性。

[1]楊欣.鏈格孢霉毒素研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)（衛(wèi)生學(xué)分冊），2000，27（3）：182-183.

[2]Forgac JH，Koch W，Carll T，et al.Mycotoxicosese.Ⅰ.Relationship of toxoc fungi to moldy-feed toxicosis in poultry [J].Avian Diseases，1962，6：363-380.

[3]李春杰，李長勝，孫雙.玉米青貯HACCP 技術(shù)與青霉菌污染防治[J].農(nóng)業(yè)系統(tǒng)科學(xué)與綜合研究，2009，3：361-363.

[4]Wadler，CS，Vanderpool，CK.Characterization of homologs of the small RNASgrs reveals diversity in function[J].Nucleic Acids Rec，2009，37（16）：5477-5485.

[5]史俊艷.臨床常見曲霉菌體外藥物敏感性及分子生物學(xué)鑒定方法研究[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文，2010.

[6]王傳武，何誠，孫朝臣，等.蛋種雞曲霉菌病的診斷[J].中國獸醫(yī)雜志，2004，40（4）：16-18.

[7]Christensen CM，Nelson G H，Mirocha CJ，et al.Toxicity to Experimental Animals of 943 Isolates of Fungi[J].Cancer Res，1968，28：2293-2295.

[8]付亮劍.飼料沙門菌污染的危害及控制[J].飼料廣角，2008，20：26-27.