劉 飛，童 武，楊 莘，鄭 浩，李國(guó)新，梁 超，田 青，童光志

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

豬偽狂犬病毒變異株單克隆抗體的制備與鑒定

劉 飛，童 武，楊 莘，鄭 浩，李國(guó)新，梁 超，田 青，童光志

為制備豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）變異毒株的單抗，以純化滅活的PRV JS-2012毒株免疫BALB/c 雌性小鼠。經(jīng)間接免疫熒光法（indirect immunof uorescence assay, IFA)篩選，獲得2 株穩(wěn)定分泌PRV 單抗的雜交瘤細(xì)胞：4D8、4F10。2株單抗經(jīng)亞型鑒定均為IgG1亞類，輕鏈為κ鏈，腹水IFA效價(jià)均達(dá)1:51 200；IFA與IHC結(jié)果顯示，二者均能與PRV毒株發(fā)生特異性反應(yīng)；Western blot結(jié)果表明，4D8與PRV反應(yīng)條帶大小約為60 kDa，而4F10不與PRV發(fā)生反應(yīng)，推測(cè)其可能針對(duì)PRV的構(gòu)象性抗原表位。該單抗的制備對(duì)PRV的抗原變異及診斷研究均有重要意義。

偽狂犬病毒；單克隆抗體；間接免疫熒光檢測(cè)；免疫組化鑒定

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

偽狂 犬 ?。≒seudorabies，PR） 是 由 皰 疹病毒科（Herpesviridae）、α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）的偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV） 引起的一種能夠使多種家畜及野生動(dòng)物共患的接觸性、急性傳染病。PRV感染有發(fā)病迅速，嗜神經(jīng)性和潛伏感染特性[1]。豬是自然宿主[2]，仔豬具有較高的發(fā)病率和死亡率。PRV感染主要引起哺乳仔豬發(fā)熱、食欲不振、嘔吐、腹瀉、神經(jīng)癥狀，

妊娠母豬則表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙[3]。2011年以來(lái)，PRV變異毒株開(kāi)始流行，原有疫苗不能對(duì)其完全保護(hù)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-7]。本研究將實(shí)驗(yàn)室分離的PRV JS-2012流行毒株，進(jìn)行純化滅活后免疫小鼠，篩選能穩(wěn)定分泌PRV抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，為抗原變異及診斷研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PK-15、Marc-145、Vero及SP2/0等細(xì)胞株，PRV變異毒株(JS-2012)和弱毒疫苗株(Bartha-K61)，豬繁殖與呼吸綜合征 病 毒(Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)，豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）及豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）均為本實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑PCR試劑購(gòu)自大連寶生物有限公司（TaKaRa）；DNA提取試劑盒購(gòu)自上海華舜科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；Alexa Fluor? 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody購(gòu)自Invitrogen公司；次黃嘌呤胸腺嘧啶（HT）、次黃嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶（HAT）、聚乙二醇PEG均購(gòu)自Sigma公司；吡咯（BEI）購(gòu)自TCI公司；Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit購(gòu)自Bio-Rad。

1.3 PRV純化與滅活將PRV JS-2012病毒接種單層PK細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%CPE（細(xì)胞病變效應(yīng)，cytopathic effect）時(shí)，-80℃凍存，將總量約200 mL病毒液進(jìn)行差速離心，首先2000×g、4℃離心30 mim，去除細(xì)胞碎片與雜質(zhì)，10 000×g離心30 min，用適量PBS輕懸沉淀后，蔗糖密度梯度離心，（蔗糖梯度：底層60%蔗糖3 mL+上層30%蔗糖7 mL+病毒液1.5 mL），4℃、30 000×g離心3 h，小心用穿刺針抽出病毒層，PBS溶解病毒離心去蔗糖，適量PBS溶解病毒。吡咯（BEI）滅活病毒，滅活完全后備用。

1.4 PRV免疫取適量的純化病毒，提取DNA，gB特異引物進(jìn)行PCR鑒定，鑒定后用Nanodrop 2000

測(cè)定蛋白濃度。病毒與弗氏完全佐劑等體積混合充分乳化，免疫8周齡雌性BALB/c小鼠，100 μg/只。間隔2周，病毒與弗氏不完全佐劑乳化，進(jìn)行第2及第3次免疫。3免后2周利用間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）檢測(cè)效價(jià)，進(jìn)行細(xì)胞融合，方法參照參考文獻(xiàn)[8-10]。

1.5 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選用選擇性培養(yǎng)基HAT重懸融合細(xì)胞，加入到前1 d制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，d5用HAT半換液。觀察待克隆細(xì)胞長(zhǎng)到一定數(shù)量時(shí)，用感染JS-2012病毒的PK細(xì)胞，利用IFA檢測(cè)有融合細(xì)胞孔中的上清液，對(duì)檢測(cè)到的陽(yáng)性細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法篩選。連續(xù)進(jìn)行4次亞克隆，直至得到能穩(wěn)定分泌特異性抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，然后對(duì)該雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.6 MAb的亞型鑒定用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit按說(shuō)明書操作進(jìn)行鑒定，取制備的MAb細(xì)胞上清液150 μL加入凍干微粒管中，將試紙條放入其中10 min，觀察條帶位置。

1.7 MAb的特異性及交叉反應(yīng)性 PRV JS-2012、Bartha-K61毒株及HP-PRRSV、CSFV和PEDV感染細(xì)胞固定后，以MAb細(xì)胞上清液為一抗，以山羊抗小鼠IgG (H+L)(1:1000稀釋)作為二抗，利用IFA方法檢測(cè)MAb的特異性和交叉反應(yīng)性。

1.8 MAb的免疫組化鑒定（immunohistochemical，IHC）將感染PRV和未感染PRV的豬腦組織樣本進(jìn)行取樣、固定、包埋、切片、固定。利用EnVision? Detection Systems Peroxidase/DAB, Rabbit/ Mouse試劑盒（Dako，Denmark）進(jìn)行鑒定，MAb細(xì)胞上清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗，經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核（由武漢谷歌生物科技有限公司完成），載玻片于顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 MAb的Western blot鑒定將收取的107TCID50/ mL的病毒液，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（NC）膜上，經(jīng)5 %脫脂乳封閉，MAb細(xì)胞上清作為一抗，4℃過(guò)夜，HRP山羊抗小鼠IgG（1:6 000稀釋）作為二抗，NC膜經(jīng)曝光后顯影，定影，掃描保存圖片。

1.10 腹水制備及效價(jià)測(cè)定將降植烷以200 μL/只腹腔注射10周齡的BALB/c 小鼠，7 d 后將雜交瘤細(xì)胞腹腔注射小鼠（1 ×106個(gè)/只），待小鼠腹腔明顯脹大時(shí)取腹水，離心取上清液即為MAb腹水。腹水倍比稀釋至1:51 200倍進(jìn)行IFA效價(jià)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選將純化鑒定后的PRV JS-2012株全病毒免疫小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0融合，亞克隆。利用IFA篩選，獲得2株能穩(wěn)定分泌抗PRV MAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為4D8和4F10。

2.2 MAb亞 型 的 鑒 定利 用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit抗體亞類鑒定試劑盒鑒定MAb。4D8和4F10二者均為IgG1亞類，輕鏈均為κ鏈。

2.3 MAb的特異性及交叉反應(yīng)性利用IFA檢測(cè)MAb與各病毒的反應(yīng)情況，4D8和4F10均能與PRV JS-2012、Bartha-K61反應(yīng)，但不與HPPRRSV、PEDV和CSFV等病毒反應(yīng)，說(shuō)明2株MAb針對(duì)PRV毒株有較好的特異性，且與其他毒株不發(fā)生交叉反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4 MAb的IHC鑒定將4D8和4F10 2株MAb的細(xì)胞上清作為一抗分別與感染PRV的豬腦組織進(jìn)行免疫組化反應(yīng)，病毒感染的腦組織中出現(xiàn)棕黃色著染，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.5 MAb的Western blot鑒定將JS-2012病毒液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，收取MAb細(xì)胞上清作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體為二抗，進(jìn)行Western blot，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.6 腹水制備及效價(jià)測(cè)定雜交瘤細(xì)胞4D8和4F10制備的小鼠腹水與感染JS-2012病毒的細(xì)胞反應(yīng)見(jiàn)圖4，腹水IFA效價(jià)達(dá)到1:51 200。

3 討論

近年來(lái)，變異的PRV在我國(guó)Bartha-K61疫苗免疫豬場(chǎng)流行，現(xiàn)已分離出一些PRV變異毒株，其中部分毒株的全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成，如 BJ/YT (KC981239)、TJ (KJ789182)[11,12]、ZJ01 (KM061380)[13]、HeN1及本實(shí)驗(yàn)室分離的JS-2012 (KP257591)毒株。2011年后分離的PRV流行毒株與早期分離的PRV毒株基因組序列進(jìn)行比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)PRV流行毒株的基因組發(fā)生了較大的變異，主要位于gB等保守糖蛋白基因和gE等毒力基因及一些基因的非編碼區(qū)等區(qū)域[14]；遺傳進(jìn)化分析顯示PRV流行毒株基因組位于一個(gè)獨(dú)立的分支。為進(jìn)一步研究PRV流行毒株的抗原變異情況，建立快速的病毒診斷方法，本研究將JS-2012全病毒純化滅活后作為免疫原，制備了2株穩(wěn)定分泌PRV特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為4D8和4F10。

經(jīng)亞型鑒定2株MAb均為IgG1 亞類，輕鏈為κ鏈，二者均可與JS-2012及Bartha-K61 PRV弱毒疫苗株進(jìn)行特異性反應(yīng)，但不與HP-PRRSV、CSFV、PEDV等其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。IHC結(jié)果表明二者可與感染PRV的豬腦組織發(fā)生特異性反應(yīng)。MAb 4D8與處理的JS-2012病毒液進(jìn)行Western blot時(shí)，能與PRV 60 kDa蛋白發(fā)生反應(yīng)，推測(cè)其可能是針對(duì)PRV某蛋白線性表位的單抗。MAb 4F10與PRV進(jìn)行Western blot時(shí)無(wú)明顯條帶，但MAb 4F10可以進(jìn)行IFA和IHC反應(yīng)，推測(cè)其有可能是針對(duì)JS-2012病毒某蛋白的構(gòu)象表位產(chǎn)生的抗體。有研究表明，用β-丙內(nèi)酯滅活純化的狂犬病毒（Rabies virus，RABV），免疫后得到3株針對(duì)N蛋白的單抗，其中1株針對(duì)線性表位，能與N蛋白發(fā)生IFA、WB和IHC反應(yīng)，而另2株僅能進(jìn)行IFA反應(yīng)，經(jīng)驗(yàn)證這兩個(gè)表位為構(gòu)象表位[15]。本研究采用吡咯（EBI）滅活全病毒，與β-丙內(nèi)酯作用相似，直接作用于病毒核酸，保持免疫原性，用EBI滅活后的純病毒粒子作為免疫原，與原核表達(dá)或甲醛滅活病毒制備單抗方法相比，更容易產(chǎn)生針對(duì)構(gòu)象表位的抗體。檢測(cè)結(jié)果顯示，制備的2株單抗具備較好的特異性和敏感性，2株細(xì)胞連續(xù)傳代及凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞均能穩(wěn)定分泌抗體，表明二者具有較好的穩(wěn)定性。PRV流行毒株單抗的制備為今后抗原表位分析檢測(cè)和豬偽狂犬病的診斷奠定了基礎(chǔ)。

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PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PORCINE PSEUDORABIES VIRUS VARIANTS

LIU Fei, TONG Wu, YANG Shen, ZHENG Hao, LI GUO-xin, LIANG Chao, TIAN Qing, TONG Guang-zhi
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

In order to generate the monoclonal antibodies (MAbs) against a variant of Porcine pseudorabies virus (PRV), BALB/c mice were immunized with purif ed and inactivated PRV JS-2012 strain. Two hybridomas secreting PRV specif c MAbs were obtained and designated as 4D8 and 4F10, respectively. Both MAbs belonged to IgG1 subgroup and had κ light chains. The ascetic f uids containing either 4D8 or 4F10 showed indirect immunof uorescence assay (IFA) titers at 1:51200. Both MAbs reacted specif cally with PRV in IFA and immunohistochemical (IHC). In Western blot, MAb 4D8 reacted with 60 kDa protein of PRV while MAb 4F10 showed no obvious reactions with PRV protein, suggesting that MAb 4F10 might react with a conformational epitope. The availability of PRV MAbs was important for further research of antigenic variation and diagnosis.

Pseudorabies virus; monoclonal antibody; indirect immunof uorescence assay (IFA); immunohistochemical (IHC)

S852.659.5

A

1674-6422（2015）03-0007-05

2015-03-09

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(14ZR1448900)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014JB02)作者簡(jiǎn)介：劉飛，女，博士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn