王 欣，譚 磊，陸 鳳，徐樂樂，仇旭升，宋翠萍，孫英杰，廖 瑛，茅 翔，詹 媛，王 琰，周恩民，丁 鏟

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

DC-SIGN真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞系的建立

王 欣1,2，譚 磊2，陸 鳳2，徐樂樂1，仇旭升2，宋翠萍2，孫英杰2，廖 瑛2，茅 翔2，詹 媛2，王 琰2，周恩民1，丁 鏟2

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

為研究新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）與樹突狀細(xì)胞特異性粘附分子-3-結(jié)合非整合素分子（dendritic cell specif c intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin，DC-SIGN） 的 相 互 作 用 對NDV感 染 樹 突 狀 細(xì) 胞（dendritic cell，DC）的影響，本研究擬構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN蛋白的細(xì)胞系，為研究DC-SIGN蛋白與病毒蛋白互作提供基礎(chǔ)。以小鼠DCs提取的cDNA為模板，通過PCR方法獲得DC-SIGN基因，連入真核表達(dá)載體，并命名為pcDNA-DCSIGN，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，G418進(jìn)行藥物壓力篩選，經(jīng)RT-PCR和Western blot鑒定，獲得了一株可以高效表達(dá)DC-SIGN蛋白的HeLa細(xì)胞，且經(jīng)過多次傳代后仍然可以穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN，說明該細(xì)胞系構(gòu)建成功。

樹突狀細(xì)胞特異性粘附分子-3-結(jié)合非整合素分子；新城疫病毒；樹突狀細(xì)胞；HeLa 細(xì)胞

樹突狀細(xì)胞特異性粘附分子-3-結(jié)合非整合素 分 子（dendritic cell specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing non integrin，DC-SIGN）， 又稱CD209，由美國科學(xué)家在研究人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染機(jī)制過程中發(fā)現(xiàn)。DC-SIGN主要存在于樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）表面，屬于C型凝集素受體超家族，為Ⅱ型跨膜蛋白[1]，由胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞漿外區(qū)組成，其中跨膜區(qū)含有15個氨基酸殘基，主要與DC-SIGN在膜表面的定位有關(guān)[2]。DC-SIGN通過依賴Ca2+的碳水化合物識別區(qū)域（carbohydrate recognition domain，CRD）形成寡聚體，增強(qiáng)與抗原的結(jié)合能力。DC-SIGN主要可以與ICAM-2、ICAM-3等細(xì)胞間黏附分子相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用，且在感染性和炎癥性正負(fù)免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[2]。DC-SIGN參與DCs對病原體的識別與攝入，在DCs的黏附調(diào)停，遷移，炎癥反應(yīng)，激活初級T細(xì)胞，觸發(fā)免疫反應(yīng)以及病毒的感染過程中都扮演著關(guān)鍵的角色[3,4]。

近年來，隨著對DC-SIGN的研究不斷深入，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其在黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原攝取方面的作用。目前研究已發(fā)現(xiàn)多種病原微生物，如HIV-1、真菌、埃博拉病毒、登革熱病毒、SARS冠狀病毒的免疫抑制或免疫逃逸都與DC-SIGN有關(guān)[5-7]。本實驗室前期在研究新城疫病毒（Newcastle virus disease，NDV）感染DCs引起淋巴細(xì)胞增殖發(fā)生抑制的過程中，發(fā)現(xiàn)NDV感染DCs可能受到DCSIGN蛋白的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響NDV感染DCs的效力。本研究擬構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN蛋白的細(xì)胞系，為研究DC-SIGN蛋白與NDV病毒蛋白互作提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑實驗動物C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司；HeLa細(xì)胞和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/myc-His為本實驗室保存；RPMI 1640培養(yǎng)基、PBS購自Hyclone公司； Fetal bovine serum購自Gibco公司；GM-CSF、IL-4購

自eBioscience公司；轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒小量提取試劑盒購自QIAGEN公司；LipofectamineTM2000和G418購自life technologies公司；T4 DNA連接酶、DNA限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NheⅠ購自TaKaRa公司；小鼠抗DC-SIGN抗體和山羊抗小鼠IgG抗體均購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中的DC-SIGN的基因序列，用軟件Primer 5.0設(shè)計了相應(yīng)的引物。上 游 引 物：5'- GCGCTAGCGCCACCATGAGT G A T T C T A A G G A A A T G G G G A-3'；下游引物：5'- GCGCTAGCGCCACCATGAGT，GATTCTAAGGAAATGGGGA-3'。其中在上游引物添加了NheⅠ酶切位點及保護(hù)堿基，在下游引物添加了XhoⅠ酶切位點和保護(hù)堿基。

1.2.2 分離和培養(yǎng)小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞 無菌條件下取小鼠的脛骨和股骨，用含1%雙抗的PBS吹洗骨髓直至髓腔發(fā)白，收集液用40目細(xì)胞篩過濾，300×g 離心8～10 min；棄上清，用6 mL紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，37℃放置3 min后補(bǔ)加PBS上下顛倒混勻，300×g 離心10 min；棄上清，沉淀PBS重懸，300×g離心10 min洗滌1次；棄上清，收集沉淀，并用1 mL含10% FBS、1%雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計數(shù)。將分離得到的骨髓細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加1 mL含有GM-CSF（10 ng/mL）和IL-4（10 ng /mL）的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，細(xì)胞終濃度為2×106個/ mL，然后置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至d3和d5時，半量換液1次，同時補(bǔ)充GM-CSF和IL-4。

1.2.3 DC-SIGN分子克隆 將培養(yǎng)7 d的DCs從12孔細(xì)胞板中吹下來，300×g離心10 min，棄上清，1 mL Trizol 重懸沉淀，室溫放置5 min，每1 mL Trizol液加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，10 800×g、4℃離心5min，棄上清，按每1 mL Trizol 液加500 μL的比例加入異丙醇，－20℃放置30 min，10 800×g離心10 min，棄上清，加入70%乙醇1 mL，混勻后4℃，10 800×g離心5 min，棄

上清，干燥3～5 min，最后用30～50 μL DEPC水溶解沉淀。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA模板30 μL、隨機(jī)引物1 μL、DEPC水6 μL、10 mmol/L dNTP 1μL、5×M-MLV buffer 10 μL，在70℃水浴中加熱10 min后迅速放置在冰浴上冷卻，加入RNA酶抑制劑1 μL、反轉(zhuǎn)錄酶1 μL（反轉(zhuǎn)錄體系為50 μL），在37℃反應(yīng)2 h后置于75℃反應(yīng)5 min，合成的cDNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中模板DC-SIGN 1 μL、上下引物各1 μL、2×PCR mix 25 μL、滅菌ddH2O 22 μL，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性 1 min；94℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸 45 s，30個循環(huán)后；72℃延伸7 min。

1.2.4 DC-SIGN重組載體的構(gòu)建與鑒定 PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠回收大小為717 bp左右的條帶，連接pGEM-T easy載體，NheⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接到同樣酶切位點的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/myc-His，轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單個陽性菌落擴(kuò)增后進(jìn)行質(zhì)粒提取，雙酶切鑒定，將鑒定為陽性的質(zhì)粒送上海生工公司測序，正確序列命名為pcDNA-DCSIGN。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選 將長滿單層的HeLa細(xì)胞以3×105個/孔接種于6孔板中，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿至60%時，按轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的pcDNA-DC-SIGN載體，同時設(shè)未加藥物組和空白對照組。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定G418最佳藥物篩選濃度為800 mg/L，轉(zhuǎn)染24 h后開始加入藥物，約7 d后，細(xì)胞開始出現(xiàn)大量死亡，此時開始隔天換液。當(dāng)存活細(xì)胞形成小簇時，將其消化，經(jīng)有限稀釋法傳代至96孔板中，進(jìn)行陽性克隆細(xì)胞的篩選，此時G418濃度仍為800 mg/L[8]。將生長良好的單細(xì)胞克隆傳代至24孔板, 當(dāng)細(xì)胞生長良好時，再將細(xì)胞傳代至6孔板，逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)加壓培養(yǎng)傳代1個月, 經(jīng)2次凍存復(fù)蘇，期間對陽性克隆細(xì)胞進(jìn)行DC-SIGN蛋白表達(dá)情況的檢測。

1.2.6 Western blot鑒定DC-SIN蛋白表達(dá) 將篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN的HeLa細(xì)胞上清吸棄，收集細(xì)胞，常規(guī)方法處理細(xì)胞樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80 V恒壓電泳150 min，電泳后將凝膠取出，250 mA恒流轉(zhuǎn)印90 min。轉(zhuǎn)印好的NC膜置于含5%脫脂乳的TBST中4℃封閉1 h，TBST漂洗3次，每次10 min；加入1:1000的Anti-DC-SIGN antibody一抗，4℃作用過夜；再加入辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗鼠二抗（1: 8000稀釋），作用1 h， ECL增強(qiáng)顯色試劑盒顯色。將NC膜用一抗二抗去除液處理后，重新封閉，以小鼠β-actin抗體為一抗（1:5000稀釋）和HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗（1:8000稀釋）重新孵育，ECL增強(qiáng)試劑盒顯色，Western blot分析β-actin蛋白。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增DC-SIGN基因片段結(jié)果PCR擴(kuò)增DC-SIGN目的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得大小約717 bp的明亮條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。

2.2 DC-SIGN重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及測序結(jié)果將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA-DC-SIGN，經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，能切下清晰的717 bp大小的目的條帶，如圖2。同時，將測序結(jié)果與預(yù)測序列對比，與原序列同源性100%，表明成功構(gòu)建pcDNA-DCSIGN真核表達(dá)質(zhì)粒。

2.3 RT-PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞中DC-SIGN經(jīng)RT-PCR檢測，在成功轉(zhuǎn)染DC-SIGN基因的HeLa細(xì)胞中擴(kuò)增到717 bp的特異性條帶。

2.4 Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞DC-SIGN蛋白表達(dá)結(jié)果Western blot檢測DC-SIGN蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示DC-SIGN在HeLa細(xì)胞系中成功表達(dá)，同時，在未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中不表達(dá)；細(xì)胞內(nèi)參蛋白β-actin在兩組細(xì)胞中均有表達(dá)，說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DC-SIGN細(xì)胞系構(gòu)建成功。

3 討論

已有的研究結(jié)果顯示，DC-SIGN與病原體結(jié)合后對DCs細(xì)胞功能的影響，決定了病原體侵入動物體的最終結(jié)局[2]，因而定向研究DC-SIGN與感染性疾病的關(guān)系，可以幫助我們從免疫水平找到治療和預(yù)防病原體的有效途徑。新城疫病毒（NDV）是副粘病毒科（paramyxoviridae）、副粘病毒亞科（paramyxovirinae）、腮腺炎病毒屬（rubulavirus）的一種單股負(fù)鏈RNA病毒，編碼核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）及大蛋白（L）6種結(jié)構(gòu)蛋白，其中HN蛋白和F蛋白與病毒的毒力和致病性密切相關(guān)。ND主要引起侵害禽類的呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，每年給全世界養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)NDV可能通過感染DCs，使T淋巴細(xì)胞增殖抑制，從而使機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制的效果[10]，目前對于其具體作用機(jī)理還不清楚。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，由于DC-SIGN的CRD可以識別糖蛋白的N-link糖基化位點，而NDV的HN蛋白在119、341、433、481位氨基酸可以發(fā)生N-糖基化，因此推測NDV感染DCs可能是依賴與DC-SIGN的相互作用。為了進(jìn)一步確證這種推斷，本研究構(gòu)建了pcDNA-DC-SIGN真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，通過G418加壓篩選及有限稀釋法獲得了穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN分子的細(xì)

胞系。經(jīng)PCR和Western blot方法驗證，該細(xì)胞系能夠正確并且穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN蛋白，反復(fù)凍存和復(fù)蘇以及連續(xù)傳代培養(yǎng)數(shù)代后的細(xì)胞仍然能夠穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN蛋白，說明細(xì)胞系構(gòu)建成功，這為后續(xù)研究NDV病毒蛋白與DC-SIGN的相互作用奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為研制預(yù)防NDV疫苗提供新的方法和思路。

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CONSTRUCTION OF EUKARYOTIC EXPRESSION VECTOR AND ESTABLISHMENT OF HELA CELL LINE WITH STABLE EXPRESSION OF DC - SIGN

WANG Xin1,2, TAN Lei2, LU Feng2, XU Le-le1, QIU Xu-sheng2, SONG Cui-ping2, SUN Ying-jie2, LIAO Ying2, MAO Xiang2, ZHAN Yuan2, WANG Yan2, ZHOU En-min1, DING Chan2
(1.College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)

To investigate the inf uence of the interaction between Newcastle diseases virus (NDV) protein with dendritic cells specif c adhesion molecules - 3 - grabbing non-integrin (DC-SIGN) on NDV infection of dendritic cell (DC), we generated a Hela cell line stably expressing DC - SIGN protein for studying DC - SIGN protein and virus protein interactions. The cDNA was extracted from mouse DCs and used as template. The DC - SIGN gene was amplif ed in polymerase chain reaction (PCR) for construction of eukaryotic expression vector pcDNA-DC-SIGN, which was then transfected into HeLa cells using LipofectamineTM2000. A HeLa cell line eff ciently expressing DC - SIGN protein was identif ed through RT-PCR and Western blot, and the specif c Hela cell line was stable after many passages.

DC-SIGN; Newcastle diseases virus; dendritic cells; HeLa cells

S852.659.5

A

1674-6422（2015）03-0012-05

2015-03-20

國家自然基金青年基金（31402182）

王欣，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

周恩民，E-mail：zhouem@nwsuaf.edu.cn；丁鏟, E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn