程霄翔 王世鄂

（福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，福州 350108）

小鼠囊胚滋養(yǎng)外胚層的形成與雌激素受體 α

程霄翔 王世鄂*

（福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，福州 350108）

滋養(yǎng)外胚層由具有上皮細(xì)胞特性的桑葚胚外層細(xì)胞發(fā)育而來，為腔化以及囊胚順利著床奠定重要基礎(chǔ)。滋養(yǎng)外胚層的形成受一系列復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，包括上皮細(xì)胞特性建立和定向分化。雌激素受體 α（ERα）是一種配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于許多細(xì)胞和組織中，參與調(diào)節(jié)生理代謝。有研究報(bào)道 ERα與調(diào)控滋養(yǎng)外胚層形成的分子存在關(guān)聯(lián)。本文旨在對(duì)小鼠滋養(yǎng)外胚層形成的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行概述。

滋養(yǎng)外胚層；上皮細(xì)胞；分化；雌激素受體 α

小鼠早胚的發(fā)育經(jīng)歷一系列生理事件，主要包括合子型基因激活，致密化以及腔化。8-細(xì)胞后期，致密化起始，早胚開始出現(xiàn)細(xì)胞系分化，產(chǎn)生滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm，TE）和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）?，F(xiàn)對(duì)滋養(yǎng)外胚層形成機(jī)制的研究進(jìn)展以及雌激素受體 α（ERα）與其潛在的關(guān)聯(lián)作綜述。

1.滋養(yǎng)外胚層的形成

功能性的滋養(yǎng)外胚層形成于32-細(xì)胞階段，其完善的上皮結(jié)構(gòu)正是啟動(dòng)腔化的關(guān)鍵，所產(chǎn)生的囊胚腔為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)育營(yíng)造特定的液體環(huán)境。囊胚后期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)再分化為原始內(nèi)胚層（primitive endoderm）和上胚層（epiblast）。因此，滋養(yǎng)外胚層既調(diào)節(jié)囊胚腔的形成，也影響著囊胚后續(xù)的發(fā)育成熟。滋養(yǎng)外胚層的形成過程主要包括上皮細(xì)胞特性的建立和細(xì)胞分化。

1.1 上皮細(xì)胞特性建立與滋養(yǎng)外胚層

在小鼠早胚發(fā)育過程中，滋養(yǎng)外胚層是第一個(gè)分化的單層上皮組織，具有上皮細(xì)胞的特性，如細(xì)胞存在極性（頂端-基底端極性結(jié)構(gòu)）、細(xì)胞間連接和定向物質(zhì)運(yùn)輸?shù)取６{(diào)控滋養(yǎng)外胚層上皮細(xì)胞特性建立的一系列基因主要包括分離缺陷（partitioning-defective，PAR）蛋白家族、緊密連接（tight junction，TJ）相關(guān)蛋白和鈉鉀磷酸腺苷激酶（Na＋／K＋-ATPase）。

1.1.1 分離缺陷蛋白家族

PAR蛋白家族參與不同類型細(xì)胞的極性構(gòu)建［1］。同樣，在小鼠囊胚滋養(yǎng)外胚層極性結(jié)構(gòu)的形成中PAR蛋白家族也有重要作用。免疫熒光顯示在小鼠2-細(xì)胞發(fā)育至8-細(xì)胞的過程中，PAR6的同系物PARD6b和PAR1的同系物 EMK1蛋白集中分布在胞核內(nèi)，而在致密化起始的8-細(xì)胞后期出現(xiàn)極性分布：EMK1蛋白定位于外層細(xì)胞的基底及基底外側(cè)，PARD6b蛋白則定位在外層細(xì)胞的頂部區(qū)域［2］。敲除PARD6b基因的受精卵雖能進(jìn)行正常卵裂和致密化，但滋養(yǎng)外胚層的極性結(jié)構(gòu)被破壞，無法產(chǎn)生囊胚腔［3］。Plusa等發(fā)現(xiàn) PAR3和非典型蛋白激酶 C（atypical protein kinase C，aPKC）分布在滋養(yǎng)外胚層的頂端和頂側(cè)區(qū)域，下調(diào) PAR3和 aPKC可促進(jìn)卵裂球形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，抑制滋養(yǎng)外胚層的形成［4］。雖然有些研究提示PAR蛋白家族影響卵裂球的極性，但PAR蛋白家族如何調(diào)節(jié)卵裂球極性以及影響滋養(yǎng)外胚層分化的具體機(jī)制尚未清楚，需進(jìn)一步研究。

1.1.2 緊密連接相關(guān)蛋白

多種與 TJ有關(guān)的蛋白相互結(jié)合后形成的蛋白復(fù)合體分布于滋養(yǎng)外胚層的基底外側(cè)區(qū)域。因此，TJ是滋養(yǎng)外胚層極性構(gòu)建的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

卵裂球細(xì)胞間黏附是形成TJ蛋白復(fù)合體的前提。Fierro-Gonzalez等人利用活細(xì)胞成像技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)一種依賴上皮鈣粘素（epithelial cadherin，E-cadherin）的絲狀偽足調(diào)控著致密化過程中細(xì)胞間的黏附［5］。而敲除 E-cadherin早胚的外層細(xì)胞中與 TJ形成相關(guān)蛋白的分布異常，導(dǎo)致細(xì)胞極性受到影響，且無法形成囊胚腔［6］。

小鼠 8-細(xì)胞后期，TJ蛋白復(fù)合體開始逐步形成［7］。首先，8-細(xì)胞后期 ZO-1α-亞型和 Rab13開始聚集在細(xì)胞間的連接點(diǎn)處。在16-細(xì)胞期間，Cingulin和 ZO-2進(jìn)一步聚集。直到 32-細(xì)胞階段，伴隨Occludin和ZO-1α＋亞型的結(jié)合，成熟的TJ蛋白復(fù)合體構(gòu)建完成，早胚開始形成囊胚腔。致密化期間PARD6b、PKCZ（aPKCzeta）和PARD3逐漸結(jié)合在TJ蛋白復(fù)合體上，提示PAR蛋白家族參與對(duì)小鼠早胚TJ的構(gòu)建和維持［2］。另外，RT-PCR和免疫熒光顯示，小鼠滋養(yǎng)外胚層有Claudin4、Claudin6和 Claudin7等蛋白表達(dá)，用 Claudin4和 Claudin6的活性抑制劑 GST-C-CPE進(jìn)行4-細(xì)胞胚體外培養(yǎng)，結(jié)果無法形成正常囊胚，表現(xiàn)為無囊胚腔或僅出現(xiàn)沒有擴(kuò)張的不成熟囊胚腔，這結(jié)果表明 Claudin4和Claudin6參與滋養(yǎng)外胚層中 TJ復(fù)合體的構(gòu)建［8］。

1.1.3 鈉鉀磷酸腺苷激酶

Na＋／K＋-ATPase是由 α，β和 γ亞型構(gòu)成的質(zhì)膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，調(diào)節(jié)水分子滲入滋養(yǎng)外胚層形成積液腔［9］。而Na＋／K＋-ATPase的抑制劑 Ouabain能使滋養(yǎng)外胚層滲透性紊亂，抑制囊胚的形成［10］。

在囊胚形成過程中，雖有多種 Na＋／K＋-ATPase亞型表達(dá)，但只有 α1和 β1兩種亞型定位在滋養(yǎng)外胚層基底外側(cè)膜上［11］。敲除Na＋／K＋-ATPase α1亞型基因的早胚依然可以維持滋養(yǎng)外胚層的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠形成囊胚腔，但囊胚無法著床于子宮，因?yàn)樽甜B(yǎng)外胚層結(jié)構(gòu)的完整性被破壞［12］。Na＋／K＋-ATPase β1亞型在腔化啟動(dòng)前迅速上調(diào)。Madan等人利用Na＋／K＋-ATPase β1亞型的反義寡核苷酸能使體外培養(yǎng)的1-細(xì)胞胚絕大多數(shù)停滯在桑葚胚期且與緊密連接有關(guān)蛋白的極性分布被破壞［13］。在小鼠囊胚滋養(yǎng)外胚層中含有兩種Na＋／K＋-ATPase γ亞型的剪接變異體，并且 Na＋／K＋-ATPase γ亞型調(diào)節(jié)Na＋／K＋-ATPase的活性，反義敲除 Na＋／K＋-ATPase γ亞型基因后會(huì)延遲囊胚腔的產(chǎn)生［11］。

1.2 細(xì)胞分化與滋養(yǎng)外胚層

卵裂球細(xì)胞分化始于 8-細(xì)胞后期，通過對(duì)稱和不對(duì)稱分裂子細(xì)胞被分配到早胚的外部和內(nèi)部區(qū)域，即外層細(xì)胞和內(nèi)部細(xì)胞，隨后再分別分化成滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。許多分子參與滋養(yǎng)外胚層定向分化的調(diào)控，其中尾型同源盒基因 2（caudal-related homeobox 2，Cdx2）和 TEA域家族成員 4（TEA domain family member 4，Tead4）是起主導(dǎo)作用的兩種基因。

1.2.1 Cdx2

Cdx2開始在8-細(xì)胞胚階段表達(dá)，并且不均勻分布在各個(gè)卵裂球中。Cdx2表達(dá)較多的卵裂球隨后更趨向?qū)ΨQ分裂，為滋養(yǎng)外胚層的形成提供更多極性的外層細(xì)胞［14］。Ajduk等研究發(fā)現(xiàn)，增加 Cdx2表達(dá)將促使胞核更接近于卵裂球的頂端，從而增加卵裂球的對(duì)稱分裂。相反，Cdx2表達(dá)減少使胞核更靠近卵裂球基底部，卵裂球?qū)⑦M(jìn)行不對(duì)稱分裂產(chǎn)生非極性的內(nèi)部細(xì)胞［15］。致密化期間 Cdx2主要在外層細(xì)胞中表達(dá)，囊胚期時(shí)完全定位在滋養(yǎng)外胚層的胞核內(nèi)。敲除合子型Cdx2的早胚雖能腔化，但隨后囊胚腔崩解，且與滋養(yǎng)外胚層分化有關(guān)的 Eomes和 Fgfr2的表達(dá)下調(diào)［16］。而合子型Cdx2缺陷的早胚能夠腔化可能是因?yàn)闅埩舻哪冈葱?Cdx2［17］。若同時(shí)消除母源性和合子型的Cdx2，在致密化期間的外層細(xì)胞內(nèi)極性分子如 Par3和 aPKC的表達(dá)和定位受到破壞，早胚阻滯在桑葚胚階段［17］。

1.2.2 Tead4

Tead4在滋養(yǎng)外胚層的分化過程中起必要的調(diào)節(jié)作用［18］。雖然在所有卵裂球中都有Tead4的表達(dá)，但Home等研究認(rèn)為 Tead4只在外層細(xì)胞中高表達(dá)并定位在胞核內(nèi)。因此，Tead4不同的定位分布決定著其隨后的發(fā)育命運(yùn)［19］。Tead4缺陷的早胚無法完成腔化，并檢測(cè)不到與滋養(yǎng)外胚層分化有關(guān)基因的表達(dá)，包括 Cdx2，Eomes和 Fgfr2［20］。Nishioka等研究發(fā)現(xiàn) Hippo-YAP信號(hào)通路參與 Tead4對(duì)于滋養(yǎng)外胚層的調(diào)節(jié)［21］。在外層細(xì)胞中Yap定位的胞核中并與Tead4共同調(diào)節(jié)Cdx2表達(dá)，而在內(nèi)部細(xì)胞中Hippo-YAP信號(hào)通路被激活，Yap被 Lats 1／2激酶磷酸化后定位于胞質(zhì)中，后發(fā)生降解，從而抑制內(nèi)部細(xì)胞中Cdx2的表達(dá)。另有研究表明抑制 RHO-ROCK信號(hào)通路會(huì)激活外層細(xì)胞中Hippo-YAP信號(hào)通路，從而 導(dǎo)致 Yap被磷酸 化，抑 制 滋 養(yǎng) 外胚 層 的形 成［22］。

此外，還有其他分子參與滋養(yǎng)外胚層分化的調(diào)節(jié)。Gata3選擇性高表達(dá)于滋養(yǎng)外胚層中，Gata3蛋白直接結(jié)合 Cdx2內(nèi)含子上一段保守的 GATA序列調(diào)控 Cdx2轉(zhuǎn)錄，并協(xié)同 Cdx2誘導(dǎo)滋養(yǎng)外胚層分化有關(guān)基因的表達(dá)［23］。另外，Maria等人利用 Sox2反義寡核苷酸進(jìn)行小鼠 2-細(xì)胞胚體外培養(yǎng)，結(jié)果阻滯在桑葚胚階段，無法形成滋養(yǎng)外胚層［24］。

2.雌激素受體 α

雌激素受體（estrogen receptor，ER）在生物體各類型的組織和器官都發(fā)揮著重要作用，其主要分為ERα和 ERβ兩型［25］。近些年，膜受體GPR30被認(rèn)為是一種非典型的 ER，但依然存在爭(zhēng)議［26］。

ERα作為類固醇核受體家族成員之一，主要包含5個(gè)功能區(qū)：DNA結(jié)合域（DBD）、鉸鏈區(qū)、配體結(jié)合域（LBD）及兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)AF-1區(qū)和 AF-2區(qū)。其中 AF-2區(qū)需要與配體結(jié)合后才行使激活靶基因轉(zhuǎn)錄的功能［27］。ERα既可以通過雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）直接調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，又能耦合其他轉(zhuǎn)錄因子如AP-1和Sp1間接調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［28-30］。ERα結(jié)合配體后將引起結(jié)構(gòu)的改變，從而招募核受體共調(diào)節(jié)因子完成組蛋白修飾，激活或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄［31］。另外，ERα也能夠通過多種類型的翻譯后修飾如磷酸化（phosphorylation）來完成對(duì)自身穩(wěn)定性和活性的調(diào)節(jié)［32］。

ERα不僅定位在胞核內(nèi)直接或間接調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，也分布在胞膜上協(xié)同核內(nèi)ERα調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［33］。利用pull-down技術(shù)，Kumar等人發(fā)現(xiàn) ERα作為細(xì)胞膜上 G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）介導(dǎo)雌激素的非基因組效應(yīng)（nongenomic signaling）［34］。

3.雌激素受體 α與滋養(yǎng)外胚層的調(diào)控基因

盡管早先研究發(fā)現(xiàn)敲除 ERα基因的小鼠沒有直接體現(xiàn)胚胎的致死性，但 Zhang等人研究表明抑制小鼠早胚中 ERα的活性將阻止 2-細(xì)胞胚向 4-細(xì)胞胚過渡并且降低與合子基因型激活相關(guān)基因MuERV-L的表達(dá)水平［35，36］。提示 ERα在早胚發(fā)育過程中起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn) ERα基因在小鼠植入前胚發(fā)育過程中呈現(xiàn)階段性表達(dá)，在 2-細(xì)胞胚時(shí)ERα mRNA開始減少，但桑葚胚和囊胚階段又可被檢測(cè)到［37，38］。另外，ERα特異性抑制劑（MPP）抑制體外培養(yǎng)的小鼠 8-細(xì)胞胚發(fā)育至囊胚，而ERβ抑制劑（PHTPP）的抑制效果不明顯［39］。這些結(jié)果提示ERα在囊胚發(fā)育過程中存在一定作用。

研究已發(fā)現(xiàn) ERα與調(diào)控滋養(yǎng)外胚層形成的分子存在關(guān)聯(lián)，包括與上皮細(xì)胞特性建立有關(guān)的 Occludin和肝激酶 B1（liver kinase B1，LKB1），以及與定向分化有關(guān)的 Gata3和 Sox2。

3.1 雌激素受體 α與上皮細(xì)胞特性建立

研究表明高濃度雌激素減弱緊密連接的阻力（tight-junctional resistance，RTJ）是通過 ERα引起 Occludin蛋白水解，導(dǎo)致 65-kDa亞型向 50-kDa轉(zhuǎn)變［40］。而 Occludin與滋養(yǎng)外胚層極性建立密切相關(guān)。正如 Kim等人利用Occludin抗體培養(yǎng)8-細(xì)胞胚和桑葚胚，其隨后腔化的進(jìn)程受到阻滯并且滋養(yǎng)外胚層的滲透性被破壞［41］。且在早胚發(fā)育過程里雖有多種 Occludin蛋白亞型表達(dá)，但研究表明 65-kDa亞型的 Occludin蛋白調(diào)控著32-細(xì)胞階段 TJ蛋白復(fù)合體的成熟，從而啟動(dòng)囊胚腔化［42］。提示 ERα可能參與早胚發(fā)育過程中 Occludin蛋白亞型的轉(zhuǎn)變，從而調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層極性的建立。另外，LKB1調(diào)節(jié)小鼠早胚上皮細(xì)胞的極性，完全消除 LKB1的小鼠早胚的上皮結(jié)構(gòu)完整性被破壞［43］。Krawchuk等人研究發(fā)現(xiàn)在 MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，干擾 ERα表達(dá)會(huì)增強(qiáng)LKB1的轉(zhuǎn)錄活性，并提高LKB1的mRNA和蛋白水 平［44］。

3.2 雌激素受體 α與細(xì)胞分化

Gata3蛋白與滋養(yǎng)外胚層分化相關(guān)，在乳腺癌中其伴隨著 ERα表達(dá)，只有在 ERα陽性乳腺癌中，Gata3蛋白才高表達(dá)［45］。研究已發(fā)現(xiàn)在ERα陽性乳腺癌細(xì)胞中，Gata3蛋白結(jié)合于 ERα基因的順勢(shì)調(diào)控元件并招募 RNA聚合酶Ⅱ到ERα啟動(dòng)子上啟動(dòng)ERα轉(zhuǎn)錄，而且 ERα通過結(jié)合 Gata3基因下游的調(diào)控元件也能直接調(diào)節(jié) Gata3的轉(zhuǎn)錄水平［46］。此外，有研究報(bào)道，在 ERα陽性乳腺癌細(xì)胞中 ERα通過miR-140調(diào)節(jié) Sox2的表達(dá)［47］。ERα能夠通過結(jié)合miR-140啟動(dòng)子上的ERE抑制 miR-140轉(zhuǎn)錄，從而減少miR-140對(duì) Sox2表達(dá)的抑制。

4.展望

滋養(yǎng)外胚層既調(diào)控著囊胚腔的形成，又為早胚著床于子宮奠定重要基礎(chǔ)。因此，有關(guān)滋養(yǎng)外胚層形成機(jī)制的研究對(duì)于在輔助生殖技術(shù)（ART）中改善囊胚的質(zhì)量并提高胚胎移植的成功率具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。形成完善的滋養(yǎng)外胚層需要與上皮細(xì)胞特性建立以及細(xì)胞定向分化有關(guān)分子的協(xié)同調(diào)控。相關(guān)研究表明 ERα與這些分子存在關(guān)聯(lián)，如 Occludin、LKB1、Gata3和 Sox2，但在早胚發(fā)育過程中是否同樣存在相互協(xié)調(diào)的作用未見報(bào)道，ERα如何調(diào)控滋養(yǎng)外胚層的形成值得深入研究闡明。

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Trophectoderm formation of mouse blastocysts and estrogen receptor-α

Cheng Xiaoxiang，Wang Shi’e*
（Department of Anatomy，Histology and Embryology，School of Basic Medical Sciences，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350108，China）

The trophectoderm is derived mainly from outside cells of morula possessing epithelial cell characteristics，and it lays the foundations for cavitation and successful implantation of the blastocyst.The formation of trophectoderm is regulated by a series of complex molecular networks，including the establishment of epithelial cell characteristics and the directed differentiation.Estrogen receptor-α（ERα）is a ligand-dependent transcription factor，which is widely present in various types of cells and tissues to regulate physiological metabolism.Studies have reported that ERα is associated with the molecules regulating the formation of trophectoderm.This article aims at summarizing the molecular mechanisms of trophectoderm formation in mouse blastocysts.

Trophectoderm；Epithelial cell；Differentiation；Estrogen receptor-α

R329.1

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.024

2015-06-30

2015-09-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助（81170624）

程霄翔，男（1991年），漢族，碩士研究生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：shineww＠163.com