郝綏綏 許海燕

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院,北京100005)

創(chuàng)傷環(huán)境巨噬細胞表型的時空相關(guān)性及其對生物材料支架引導組織再生與修復的意義

郝綏綏 許海燕#*

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院,北京100005)

炎癥反應(yīng)是機體對損傷和異物的正常應(yīng)答，炎癥的強度和持續(xù)時間影響生物材料在體內(nèi)的相容性和穩(wěn)定性。巨噬細胞是調(diào)控機體免疫和炎癥反應(yīng)的重要細胞，因此它對生物材料的響應(yīng)性在認知材料-機體反應(yīng)中有決定性作用。系統(tǒng)闡述巨噬細胞表型與機體創(chuàng)傷環(huán)境及對后期的修復和(或)再生、巨噬細胞表型與相關(guān)生物材料之間的相互作用，并對其未來發(fā)展方向進行評述。

巨噬細胞表型；創(chuàng)傷環(huán)境；生物材料；修復；再生

引言

創(chuàng)傷后的組織修復是生物進化過程中機體所獲得的一種自我保護機制。在損傷因子的刺激下，機體調(diào)動一切可能的手段，使損傷組織得以修復。創(chuàng)傷修復過程由細胞、細胞因子、細胞外基質(zhì)等共同參與完成，并在機體調(diào)控下呈現(xiàn)高度的有序性、完整性和網(wǎng)絡(luò)性[1]。近年來，創(chuàng)傷修復與組織再生領(lǐng)域的研究重點從單純追求愈合速度逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橹匾曈腺|(zhì)量，并更加重視功能的恢復與組織的重建。

創(chuàng)傷修復過程高度有序地進行, 整個過程可劃分為3個階段: 炎癥期、增殖期和重建期。單核/吞噬細胞不僅是先天性免疫與獲得性免疫的重要效應(yīng)細胞，而且在組織修復和重建中的功能也不可或缺。機體創(chuàng)傷后, 巨噬細胞被激活，其分泌的細胞因子在整個修復過程中均起著重要的調(diào)節(jié)作用。2003年，Gordan等明確地將抗病原微生物的高炎癥狀態(tài)的巨噬細胞定義為經(jīng)典活化的巨噬細胞(classical activated macrophage)，歸為M1型巨噬細胞，主要功能是識別并清除壞死組織、細胞碎片和病原體[2]；此后，低炎癥狀態(tài)的巨噬細胞被發(fā)現(xiàn)并被定義為替代性活化的巨噬細胞(alternative activated macrophage)，歸為M2型，主要功能為抑制炎癥反應(yīng)和促進組織修復。Mantavani等對M2型巨噬細胞做了進一步的分類定義：由IL-4或IL-13誘導的巨噬細胞稱為M2a；由免疫復合物、Toll樣受體(TLR)和IL-1R配體誘導的巨噬細胞稱為M2b；由IL-10、糖皮質(zhì)激素或開環(huán)甾體類激素(如維生素D)誘導的巨噬細胞稱為M2c[3]。M2a和M2b型巨噬細胞主要執(zhí)行免疫調(diào)節(jié)功能，促進Th2免疫應(yīng)答的發(fā)生；M2c巨噬細胞的主要功能是抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生，在組織重塑過程中發(fā)揮重要作用[4]。

1 巨噬細胞在不同組織創(chuàng)傷修復中的作用

1.1 骨骼肌組織

肌肉損傷后，多種免疫細胞被激活并募集到損傷處。這些免疫細胞，尤其是巨噬細胞，對于肌肉的修復與再生十分重要。通過心臟毒素誘導的肌肉急性損傷組織中有大量的巨噬細胞浸潤。如果在注射肌肉毒素前選擇性地將小鼠巨噬細胞敲除，則會減少肌肉的再生[5]。研究發(fā)現(xiàn)，肌肉損傷后1～2 d內(nèi)開始迅速募集循環(huán)系統(tǒng)中的單核細胞，在炎癥區(qū)域轉(zhuǎn)化為巨噬細胞，釋放細胞因子、趨化因子等，并吞噬壞死的組織碎片[6]。但也有文獻報道，肌外膜和肌束膜內(nèi)有大量的靜息巨噬細胞，而在肌內(nèi)膜中數(shù)量較少，這些巨噬細胞控制著肌肉損傷過程中免疫細胞的反應(yīng)[7]。

不同活化狀態(tài)的巨噬細胞控制著肌肉修復與再生過程中的不同階段，成肌前體細胞的增殖與M1型巨噬細胞有關(guān)，而其分化和肌再生則與M2型巨噬細胞有關(guān)。外周血來源的單核細胞經(jīng)LPS、IFN-γ處理可得到Ml型巨噬細胞，M1通過分泌IL-6、IL-lβ、高濃度TNF-α、VEGF和IL-13促進自身向成肌前體細胞遷移，刺激成肌前體細胞的增殖，并抑制其過早分化；M2型巨噬細胞則吸引成肌前體細胞向其遷移，并通過分泌TGF-β和低濃度TNF-α，刺激成肌前體細胞生成肌細胞以及成熟肌管，促進肌生成[8]。Bencze等將促炎性或抑炎性的人源巨噬細胞與成肌細胞一起注射到免疫缺陷小鼠的肌肉損傷處，結(jié)果表明，促炎性巨噬細胞可以提高注射的成肌細胞參與肌肉再生的能力，擴大增殖范圍，增加遷移并延遲分化[9]。

1.2 心肌組織

在急性心肌梗死(AMI)的修復過程中，炎性細胞至關(guān)重要，其中最重要的是局部的巨噬細胞。在心肌的損傷及修復過程中，巨噬細胞的表型會發(fā)生動態(tài)改變，對急性心肌梗死后的心肌修復有積極作用[10]。AMI發(fā)生后，壞死的心肌通過釋放細胞內(nèi)的成分而激活機體固有免疫反應(yīng)，通過Toll樣受體(TLR)[11]、補體級聯(lián)系統(tǒng)和活性氧系統(tǒng)(ROS)[12]等途徑激活細胞核因子NF-κB，上調(diào)炎性趨化因子及其他細胞因子的合成，由此將炎性單核細胞募集到梗死心肌區(qū)并活化為巨噬細胞，使其通過吞噬作用清除壞死的細胞及基質(zhì)殘骸，從而消退炎性反應(yīng)，促使機體進入心肌損傷后的修復。若除去外周血的單核細胞，可導致明顯延遲心肌梗死后組織的修復過程，心肌梗死發(fā)生4周后，梗死區(qū)仍有未清除的細胞及組織碎片；與此同時，與組織修復密切相關(guān)的生長因子(如VEGF、bFGF等)的表達水平明顯降低，新生血管及肌成纖維細胞密度顯著減少[13]。Hori等將體外激活的巨噬細胞懸液局部注射至大鼠心肌梗死區(qū)，5周后計數(shù)心肌梗死區(qū)新生血管的密度、肌成纖維母細胞和自身募集單核或巨噬細胞的數(shù)量，并通過超聲心動圖評價心功能[14]。結(jié)果顯示，在AMI發(fā)生后的早期移植巨噬細胞可促進血管化和組織修復，顯著改善心室重塑和心臟功能。這些研究結(jié)果表明，自身免疫激活的巨噬細胞能促進梗死心肌的修復，而外源性巨噬細胞的移植對梗死心肌的修復起到進一步改善的作用。

1.3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)

腦小膠質(zhì)細胞由血液中單核細胞或多能單核前體細胞演變而來。根據(jù)形態(tài)，小膠質(zhì)細胞有兩種明顯不同的細胞亞型：阿米巴樣小膠質(zhì)細胞(腦巨噬細胞)和分枝小膠質(zhì)細胞(靜息小膠質(zhì)細胞)。目前的主要學術(shù)觀點認為，巨噬細胞的募集(可能也包括激活)在組織再生的一系列事件中居于最上游的位置。Schwartz指出，其他組織的修復原則同樣適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS，巨噬細胞在任何受損組織中均發(fā)揮維持、恢復和防御的基礎(chǔ)作用[15]。在發(fā)育或病理情況下，小膠質(zhì)細胞有助于軸突的生長或再生。但是，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在抑制巨噬細胞募集和激活的因子，中樞神經(jīng)受損后，巨噬細胞的募集和功能受限，表現(xiàn)為巨噬細胞的缺乏和活性的抑制，這可能是中樞神經(jīng)不能再生的一個因素[16-20]。

研究結(jié)果顯示，移植活化的自體巨噬細胞可能有助于克服CNS再生障礙，促進軸突的再生，甚至有利于脊髓功能的改善和視神經(jīng)的再生。例如，受刺激活化的小膠質(zhì)細胞能促進受損脊髓內(nèi)感覺軸突的再生[21]；從胚胎鼠腦分離的巨噬細胞可促進CNS神經(jīng)元的神經(jīng)突生長和再生，這種作用可被凝血酶致敏蛋白抗體所抑制[22]。因此，在CNS損傷部位增加活化小膠質(zhì)細胞的數(shù)量，可能有助于增強神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子和細胞外基質(zhì)(如層粘連蛋白、凝血酶致敏蛋白)的分泌，減少髓鞘相關(guān)蛋白等抑制性因素[23]，提供一個促進軸突再生的環(huán)境。

1.4 骨和血管組織

骨骼系統(tǒng)中存在特異性的巨噬細胞，又被稱為osteomac。體外實驗發(fā)現(xiàn)，將這種巨噬細胞與成骨細胞共培養(yǎng)后，能夠顯著提高成骨細胞礦化水平，并且增加胞外鈣沉積；在Fas誘導巨噬細胞凋亡的小鼠模型上發(fā)現(xiàn)，在骨塑形部位，成骨細胞失去了能力，而對照組生長板骨內(nèi)膜表面形成了大于75%的由成熟骨細胞組成的樹冠樣結(jié)構(gòu)，表明巨噬細胞在通過調(diào)節(jié)成骨細胞功能進而維持骨穩(wěn)態(tài)中有重要的作用[24]。Raggatt等通過小鼠股骨骨折模型發(fā)現(xiàn)，炎癥巨噬細胞存在于起始軟骨化中心及軟骨痂邊緣的肉芽組織內(nèi)；隨著軟骨向硬骨化的轉(zhuǎn)變，巨噬細胞始終存在；在巨噬細胞-Fas誘導凋亡的轉(zhuǎn)基因小鼠股骨骨折模型中，當巨噬細胞在手術(shù)前被剔除時，完全不能形成結(jié)痂；當巨噬細胞在結(jié)痂早期被剔除時，結(jié)痂量明顯減少；骨折5天后用巨噬細胞刺激因子治療能顯著促進軟骨痂形成，表明巨噬細胞在骨折修復中發(fā)揮了重要的作用[25]。

組織損傷和局部感染后機體最早的生理反應(yīng)是新生血管的長入和局部血流量的增加。巨噬細胞能分泌多種生物活性物質(zhì)，增強局部血流量和促進新生血管生成，從而促進傷口愈合。如(細菌)脂多糖LPS等致病原通過與巨噬細胞表面的TLR受體結(jié)合，促進巨噬細胞合成和分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，從而導致血管舒張，使CD31+內(nèi)皮祖細胞向病變部位募集和促進新生血管生成[26-27]。同樣，巨噬細胞釋放的IL-1β、TNF-α也能促進血管舒張和新生血管生成[28]。Spiller等發(fā)現(xiàn)，外周血來源的巨噬細胞經(jīng)過不同處理后得到的條件培養(yǎng)基加入到內(nèi)皮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)后，在組織重塑的起始階段M1通過分泌VEGF以啟動血管的生成，隨后M2a通過分泌PDGF-BB以募集周細胞和干細胞，進而穩(wěn)定已形成的血管系統(tǒng)，M2c則促進血管分枝形成并分泌高水平基質(zhì)金屬蛋白MMP9，后者在重塑中有重要作用，M2a表達高水平TIMP-3，不僅能抑制MMP9的酶活性，而且通過抑制VEGF結(jié)合VEGFR2來阻斷信號通路，進一步抑制血管生成。在小鼠皮下移植模型中，將多孔膠原、LPS-膠原、戊二醛-膠原3種支架分別進行比較發(fā)現(xiàn)：多孔膠原支架纖維化最明顯，且由于外力引起支架結(jié)構(gòu)的改變，纖維化包囊周圍以M2型巨噬細胞為主，沒有血管伸入；LPS-膠原支架內(nèi)浸潤大量M1型炎癥細胞，且降解速率最快；戊二醛-膠原支架能夠保持形態(tài)穩(wěn)定，兼有M1、M2型巨噬細胞，降解速率最慢，有大量血管伸入[29]。

2 生物材料對巨噬細胞表型的影響

隨著分子細胞生物學和基因工程的發(fā)展，新型生物材料(細胞和/或基因活化生物材料)的設(shè)計理念逐漸清晰，即從分子水平上控制生物材料與細胞的相互作用，引發(fā)特異性細胞反應(yīng)，抑制非特異性反應(yīng)，引導細胞黏附、分化、增殖、凋亡及細胞外基質(zhì)的重建[30]。巨噬細胞是調(diào)控宿主免疫和炎癥反應(yīng)的一個主要細胞類型，它對生物材料的響應(yīng)性在深入理解材料與宿主的相互作用中具有十分重要的地位。生物材料植入體內(nèi)時會誘發(fā)一系列事件，涵蓋了炎癥包裹、免疫細胞激活、目標細胞招募等。如何利用生物材料誘發(fā)所期望的愈合途徑，促進組織的修復或重建，是生物材料研究面臨的挑戰(zhàn)[31-32]。

生物材料植入體內(nèi)后，招募的大部分免疫細胞是單核/巨噬細胞，也有淋巴細胞參與。這些細胞可分泌多種細胞因子以調(diào)控免疫反應(yīng)，根據(jù)細胞因子所起的作用分為促進炎癥反應(yīng)或者促進創(chuàng)傷愈合反應(yīng)兩大類型。例如，TNF-α、IL-8、IL-6、IL-2促進炎癥反應(yīng)，抑制創(chuàng)傷愈合；IL-1、IL-4、IL-13抑制炎癥反應(yīng)，促進創(chuàng)傷愈合；IL-lβ既促進炎癥反應(yīng)，又促進創(chuàng)傷愈合；IL-10既抑制炎癥反應(yīng)，又抑制創(chuàng)傷愈合反應(yīng)。此外，IL-4、IL-13會促進巨噬細胞形成異物巨細胞(foreign body giant cell, FBGC)，導致生物材料的降解。因此，控制環(huán)境中的細胞因子對促進期望的反應(yīng)有重要意義[33-34]。

2.1 材料化學組成對巨噬細胞的影響

用PHSRN、RGD和PRRAVN等多肽序列修飾聚合物表面，可以調(diào)控材料介導的炎癥反應(yīng)[35]。體外實驗結(jié)果顯示，RGD修飾不足以提供使巨噬細胞融合成異物巨細胞所需的表面，而使用PHSRN與RGD多肽序列共同修飾聚合物表面則可以促進異物巨細胞的形成，PRRAVN則對異物巨細胞的形成無影響。Kao等采用RGD和PHSRN多肽序列表面修飾PEG基聚合物，觀察到材料表面引起了較弱的炎癥反應(yīng)。進一步的體內(nèi)實驗的結(jié)果顯示，將RGD和PHSRN修飾的聚乙二醇基質(zhì)植入大鼠皮下后，RGD和PHSRN多肽序列在植入后期對異物巨細胞的產(chǎn)生非常重要，但是不同結(jié)構(gòu)的PHSRN序列引起的異物巨細胞的數(shù)量不同，因此RGD和PHSRN序列在時間和(或)結(jié)構(gòu)方面介導巨噬細胞的行為[36]。Susanna等將聚對苯二甲酸乙二醇(PET)結(jié)合到磷酸膽堿(phosphorylcholin，PC)基聚合物上，發(fā)現(xiàn)PC基聚合物表面不帶電荷時能顯著減少蛋白吸附、細胞黏附和炎性細胞激活，而帶正電荷的聚合物則加強了上述反應(yīng)[37]。用戊二醛或LPS處理膠原支架并分別植入小鼠皮下，10 d后可觀察到多孔膠原支架周圍有致密的纖維化包囊，M2型巨噬細胞數(shù)量較多；用LPS處理的膠原支架內(nèi)有大量炎癥細胞浸潤；而用戊二醛處理的膠原支架內(nèi)則有大量M1、M2型巨噬細胞浸潤，且有許多血管長入，表明M1和(或)M2型巨噬細胞在血管生成和支架血管化中均具有重要的作用[38]。

殼聚糖是一種堿性多糖，廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷愈合、藥物釋放、軟組織和硬組織的重建等方面。殼聚糖能增強炎性細胞的功能，如增強多核白細胞和巨噬細胞的吞噬作用，促進巨噬細胞產(chǎn)生IL-1、TGF-β1和PDGF，促進纖維母細胞生成IL-8等，從而促進肉芽組織的生成和動物的大面積創(chuàng)傷愈合[39]。Zhao等采用酶水解的方法得到寡殼聚糖(3～10個糖單元)，發(fā)現(xiàn)其中的N-乙?；咸前房膳c巨噬細胞表面的甘露糖受體相結(jié)合，從而促進巨噬細胞吞噬寡殼聚糖，同時，刺激巨噬細胞釋放TNF-α和IL-1β等促炎性因子，誘導宿主的創(chuàng)傷愈合[40]。

2.2 支架微觀結(jié)構(gòu)對巨噬細胞的影響

巨噬細胞對生物材料的應(yīng)答與后者的尺寸有關(guān)[41]。當外源性材料的特征尺寸大于10 μm時，巨噬細胞可以快速地將其吞噬；當材料特征尺寸增大(10～100 μm)時，多個巨噬細胞就會融合形成多核巨細胞(FBGCs)；當材料的特征尺寸進一步增加時，F(xiàn)BGCs會釋放一系列物質(zhì)(如細胞因子、活性氧和蛋白酶)，以降解植入的材料。支架的孔徑尺寸也會影響巨噬細胞的應(yīng)答和后續(xù)的血管生成。例如，直徑約0.6 μm的聚乳酸納米纖維支架與直徑約1.6 μm的同樣材質(zhì)支架相比，在RAW264.7細胞系上所引起的炎癥反應(yīng)明顯減弱[42-43]。Ratner等發(fā)現(xiàn)，在心肌中植入孔徑為30～40 μm的水凝膠支架，能使血管形成達到最大化，同時最大程度地降低心肌纖維變性，并伴隨巨噬細胞向M2表型轉(zhuǎn)變增加[44]。Garg等通過改變聚合物濃度制備不同孔徑、纖維直徑的PDO支架，研究靜電紡絲支架的纖維直徑、孔徑對骨髓來源巨噬細胞(BMMΦ)表型的影響[45]。結(jié)果顯示，隨著纖維直徑和孔徑的增大，支架上的M2型巨噬細胞數(shù)量明顯多于M1型，且血管生成相關(guān)的細胞因子(如VEGF、TGF-β1、bFGF)的分泌量也相應(yīng)升高。M1型巨噬細胞大量分布于孔徑和纖維直徑均較小的支架表面，可能是支架微觀結(jié)構(gòu)的特征尺寸有利于其分泌多種降解酶。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，支架的孔徑對BMMΦ的極化有更重要的作用。上述結(jié)果提示，在支架的設(shè)計中應(yīng)注意微觀結(jié)構(gòu)的作用。

2.3 物理刺激對巨噬細胞的影響

目前，關(guān)于物理(機械)刺激對巨噬細胞表型影響的報道尚十分有限。有研究表明，激光作用于生物體或細胞，可以調(diào)節(jié)機體的免疫能力[46]。Xu等通過小鼠活體單細胞發(fā)光的方法，闡釋了He-Ne激光對巨噬細胞內(nèi)Ca2 +及其免疫活性的影響[47]，發(fā)現(xiàn)適當?shù)蛣┝縃e-Ne激光可能通過第二信使Ca2 +的介導而激活巨噬細胞，提高其免疫活性。Kao等發(fā)現(xiàn)，1 mA 200 Hz的電刺激能夠募集大量巨噬細胞，通過巨噬細胞分泌神經(jīng)生長因子、血小板來源生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子，促進糖尿病大鼠的神經(jīng)再生[48]。Ross等將經(jīng)LPS處理后的RAW264.7放在4 mT磁場下以不同頻率(5～30 Hz)處理1 h，發(fā)現(xiàn)在5 Hz的條件下能明顯抑制炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為TNF-α和NF-κB的表達水平下調(diào)[49]。Selvam等將5 Hz×4 μT×90 min外源性電磁場作用于風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察到了明顯的抗?jié)B出作用[50]。Hiroe等將低壓持續(xù)作用于人源經(jīng)PMA激活的THP-1細胞，發(fā)現(xiàn)細胞的吞噬能力隨壓力的增加而增強[51]；隨著壓力從40 mmHg逐漸增加到130 mmHg，其促進巨噬細胞的遷移和增強清道夫受體的表達作用增強[52]。

3 結(jié)語

綜上所述，不同極化狀態(tài)的巨噬細胞功能各異，在不同的病理生理情況下發(fā)揮特定的作用。巨噬細胞的可塑性決定了它們能切換其生理狀態(tài)以維持局部自穩(wěn)態(tài)。通過設(shè)計生物材料的化學組成以及運用物理刺激，有望調(diào)控巨噬細胞的極化狀態(tài)和相應(yīng)的功能，這對于深入理解生物材料誘導巨噬細胞表型的時空轉(zhuǎn)化機制，實現(xiàn)生物材料引導和促進組織的再生，具有重要的理論研究價值和誘人的應(yīng)用價值。

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The Significance of Macrophage Phenotype in Injury as well as the Biomaterials Inducing Tissue Repair and Regeneration

Hao Suisui Xu Haiyan# *

(InstituteofBasicMedicalSciencesChineseAcademyofMedicalSciences,SchoolofBasicMedicinePekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China)

The body inflammatory reaction is a normal response to injury and the presence of foreign substances.The duration and intensity of inflammation has a direct impact on biocompatibility and stability of biomaterials in vivo.Macrophage is one of the major cell types in controlling body inflammatory and immune processes,hence,its response to biomaterials is critical for identifying the biomaterial-body reaction.In this review, the correlation between macrophage phenotype and injury as well as the tissue repair or regeneration，the interaction of macrophages with biomaterials, and the future development are introduced in detail.

macrophages phenotype;injury;biomaterials;repair;regeneration

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 04.012

2015-03-01， 錄用日期:2015-05-10

國家自然科學基金(81471793)

R318

A

0258-8021(2015) 04-0475-06

# 中國生物醫(yī)學工程學會高級會員(Senior member, Chinese Society of Biomedical Engineering)

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: xuhy@pumc.edu.cn