王薇，李繼業(yè)，潘潤華，阿斯楞，廖彩仙

2.3 Laennec組織病理學(xué)分級與HYP含量的關(guān)系

肝硬化是一種或幾種致病因子長期反復(fù)作用于肝臟引起的慢性進行性彌漫性肝損害，是肝臟病變的終末階段。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要蛋白質(zhì)成分，約占機體總蛋白的25%左右，肝臟中膠原含量豐富，對肝細(xì)胞的分化、肝小葉結(jié)構(gòu)與功能的維持等有著重要的影響。肝硬化存在著以膠原為主的ECM增生沉積，其主要病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞彌漫性壞死、纖維增生，并形成再生結(jié)節(jié)和假小葉，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)不可逆改變。其膠原蛋白含量增加為正常肝組織的3～5倍[1]。羥脯氨酸（HYP）是肝臟膠原蛋白所特有的氨基酸，因此測定羥脯氨酸含量，可明確膠原總體水平，是分析組織膠原水平的標(biāo)準(zhǔn)方法，可客觀反映肝臟硬化程度[2]。

隨著膠原蛋白的沉積，肝硬化不斷進展，門脈壓力增高，肝硬化的并發(fā)癥（食管胃底靜脈曲張、腹水、肝性腦病等）隨之而來。根據(jù)有無并發(fā)癥的發(fā)生，臨床中將肝硬化分為代償期和失代償期兩個階段[3-5]。因此，肝硬化的嚴(yán)重程度存在一個明顯的組織病理學(xué)變化。隨著更加細(xì)化的臨床分期的出現(xiàn)，以及抗纖維化藥物的發(fā)展，更加細(xì)致的肝硬化組織病理學(xué)分期將更加必要[6]。Laennec組織病理學(xué)分級系統(tǒng)根據(jù)組織病理學(xué)纖維間隔及厚度的半定量方法，將肝硬化（4期）進一步分為4A、4B、4C三個階段，更好地區(qū)分了不同嚴(yán)重程度的肝硬化。

本研究收集了2013年7月至2014年6月期間我院收治的肝炎后肝硬化患者30例，研究其Laennec組織分級與臨床分期、HYP含量及肝功能的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本研究納入了2013年7月至2014年6月期間我科收治的肝炎后肝硬化患者，所有患者均經(jīng)肝活檢證實為肝硬化，血清學(xué)診斷HBV（+），經(jīng)CT、超聲檢查未發(fā)現(xiàn)明顯占位，AFP（-），排除酒精性肝硬化、自身免疫性肝硬化、膽汁淤積性肝硬化等其他因素，除外嚴(yán)重肝功能衰竭（膽紅素＞85μmol/L或肝性腦?。?、肝腎綜合征、可能存在心血管疾病、非肝硬化門脈高壓或使用其他任何藥物治療及預(yù)防食管靜脈曲張破裂出血的患者。30例患者中男24例，女6例，年齡29～64歲，平均48.33歲。

納入的患者均行胃鏡檢查，明確有無胃底食管靜脈曲張；行增強CT、肝膽超聲檢查，根據(jù)輔助檢查及術(shù)中探查情況，確定患者腹水情況；詳細(xì)詢問病史，確定有無消化道出血史；以及血清生化檢查；從而確定患者的臨床分期、Child-Pugh評分、MELD評分。患者一般基本情況見表1。

1.2 組織活檢及病理分級

術(shù)中取大小約為10 mm×10 mm肝組織，留取10 mm×5 mm肝組織放入-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?，其余組織進行石蠟包埋，HE染色，在對患者基本情況未知的情況下，由2人根據(jù)間隔厚度及數(shù)量根據(jù)進行Laennec組織病理學(xué)分級。根據(jù)Laennec組織病理學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)（表2），將肝組織分為7個等級：0級，無纖維化；1級，極少纖維化（無間隔或極少細(xì)小間隔，可有匯管區(qū)擴大或輕度竇周纖維化）；2級，輕度纖維化（偶有細(xì)隔）；3級，中度纖維化（中等度細(xì)隔，不完全纖維化）；4A級，可能或肯定的輕度肝硬化；4B級，中度肝硬化（至少兩個寬間隔）；4C級，重度肝硬化（至少一個很寬的間隔或許多小結(jié)節(jié)）（表2）。

1.3 膠原蛋白含量的測定

將肝組織標(biāo)本干燥至恒重，并精確稱取重量，加入一定量PBS（pH7.4），用均漿器仔細(xì)將標(biāo)本均漿充分，離心20 min（3000 r/min）。仔細(xì)收集上清。采用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人羥脯氨酸（HYP）水平。用純化的HYP抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中一次加入HYP再與辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的HYP抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣本中的HYP含量成正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中HYP的濃度。膠原蛋白含量與HYP含量成正相關(guān)，測定肝組織中羥脯氨酸水平。因HYP是肝臟膠原蛋白所特有的氨基酸，固HYP水平可以直接反映肝臟組織內(nèi)膠原蛋白含量，較為客觀反映肝臟硬化程度。

表1 一般資料信息

表2Laennec肝穿刺組織纖維化分級評分系統(tǒng)

1.4 臨床分期

目前臨床上根據(jù)有無主要并發(fā)癥（食管胃底靜脈曲張破裂出血、腹水、肝性腦病等），將肝硬化簡單的分為代償期與失代償期，為了更準(zhǔn)確地預(yù)測肝硬化患者的生存情況，本研究將肝硬化分為4期[5，7]。1期：無靜脈曲張、腹水；2期：有靜脈曲張，無消化道出血及腹水；3期：有腹水，無消化道出血，有或無靜脈曲張；4期，有消化道出血，可有或無腹水。其中1期、2期對應(yīng)肝硬化代償期，3期、4期對應(yīng)肝硬化失代償期。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，Laennec病理分級與臨床分期和MELD評分及肝硬化程度的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)和x2檢驗或Fisher檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Laennec組織病理學(xué)分級與臨床分期的關(guān)系

Laennec 組織病理分級與臨床分期具有顯著的相關(guān)性（r=0.58，P＜0.01）。無消化道出血史的患者病理分級為4A級占總數(shù)的57.1%，有消化道出血史的患者組織病理分級為4A級的僅為8.7%（P=0.016）。各臨床分期中組織病理分期為4A為1期100%，2期66.7%，3期33.3%，4期4.5%。全部組織病理分級為4C的患者均為肝硬化失代償期即臨床分期為3、4期。具體見表3、圖1。

表3 Laennec組織病理分級與臨床分期的關(guān)系

圖1 Laennec病理分級與臨床分期的關(guān)系

2.2 Laennec組織病理學(xué)分級與MELD評分以及Child-Pugh評分的關(guān)系

MELD評分與Laennec組織病理學(xué)分級存在明顯的相關(guān)性（r=0.60，P＜0.01）。4A、4B、4C所對應(yīng)的MELD評分分別為（9.00±1.79），（9.36±1.50），（12.46±3.43）（P＜0.01）。隨著MELD評分的增加，Laennec組織病理學(xué)分級的等級也就越高（圖2）。對于Child-Pugh評分，由于本實驗納入的病例缺少C級評分，故未能得出相應(yīng)的結(jié)論，還需進一步大范圍的研究。

2.3 Laennec組織病理學(xué)分級與HYP含量的關(guān)系

Laennec組織病理學(xué)分級與HYP具有顯著的相關(guān)性（r=0.53，P＜0.01）。隨著Laennec分級的增高，HYP含量升高，膠原蛋白含量增加，肝臟硬化程度加重。Laennec病理分級為4A級的HYP含量為（0.31±0.10）μg/g，4B級HYP含量為（0.51±0.41）μg/g，4C級HYP含量為（1.86±1.31）μg/g（P＜0.01）。見圖3。

圖2Laennec病理分級與MELD評分的關(guān)系

圖3Laennec病理分級與HYP含量的關(guān)系

3 討論

目前，關(guān)于肝纖維化的許多組織病理學(xué)分級均將肝硬化視為一個病理階段，而臨床工作中將肝硬化至少分為代償期及失代償期2個臨床階段，這種組織病理學(xué)定義的肝硬化與臨床實踐中的不同步，不利于肝硬化患者病情變化的觀察，將給臨床與科學(xué)研究帶來不少問題，特別是無法較為準(zhǔn)確的評價抗肝纖維化治療的效果。例如經(jīng)抗纖維化治療后，有望將Laennec組織病理學(xué)分級為4C的患者改善為4A，但如果按照傳統(tǒng)的病理分級，這種改善將被忽略，導(dǎo)致得出抗纖維化治療無效的錯誤結(jié)論。最新研究認(rèn)為，如果去除誘因，肝硬化存在可逆潛能。許多研究表明，在有效的抗病毒治療下，可減少肝炎后肝硬化的纖維化程度和炎癥活動度[6，8-11]，所以將肝硬化病理亞分類是及其有必要的。本研究首次將肝硬化組織病理學(xué)分類與肝功能指標(biāo)相關(guān)參數(shù)及HYP的關(guān)系進行闡述。

隨著肝硬化的進展，肝臟中膠原蛋白含量增加，正常肝細(xì)胞由纖維結(jié)締組織替代，肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞，將增加肝內(nèi)血管阻力，增加門脈壓力，從而出現(xiàn)靜脈曲張、腹水等并發(fā)癥[3]。門靜脈壓力逐漸增高是肝硬化患者病程進展的標(biāo)準(zhǔn)，并導(dǎo)致其并發(fā)癥的發(fā)生及死亡率的增高。有研究證實組織學(xué)間隔厚度與門脈壓力密切相關(guān)[12-13]，Laennec組織病理學(xué)分級就是以此為依據(jù)將肝硬化分為4A、4B、4C三個等級。2005年Baveno IV共識建議將肝硬化根據(jù)其有無靜脈曲張、腹水及食管靜脈曲張破裂出血分為4個臨床階段[10]。臨床1期、2期對應(yīng)無癥狀期，即肝硬化代償期；臨床3期、4期對應(yīng)進展期，即肝硬化失代償期。這樣的分類主要依據(jù)門靜脈高壓的臨床表現(xiàn)。

在本組研究中，失代償期患者的肝臟組織病理學(xué)分級更趨向于高的等級，而代償期患者的組織病理學(xué)分級則更趨向于較低的等級。研究表明，肝硬化組織病理學(xué)分級與膠原蛋白含量成正相關(guān)，且食管胃底靜脈曲張破裂出血的風(fēng)險隨著病理分級增高而增加。MELD評分是目前臨床廣泛應(yīng)用的評價肝功能的指標(biāo)之一，Laennec組織病理學(xué)分級與MELD評分具有很好的相關(guān)性，本研究雖未能得出Laennec組織病理學(xué)分級與Child-Pugh評分的關(guān)系，但其他學(xué)者的既往研究已證明，Laennec組織病理學(xué)分級與Child-Pugh評分具有良好的相關(guān)性[21]。Laennec組織病理學(xué)分級系統(tǒng)可以一定程度的反映肝臟硬化程度、臨床階段以及肝功能情況，因此，我們建議使用Laennec組織病理學(xué)分級更加細(xì)致的將肝硬化分級，以便臨床實踐及科學(xué)研究。肝活檢術(shù)雖然是肝硬化組織病理學(xué)評估的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在一定的不足，例如采樣的隨機誤差及肝活檢帶來的并發(fā)癥等。隨著現(xiàn)代科技的進步，一些采用無創(chuàng)的方式測定肝纖維化的技術(shù)[14-15]，如瞬時彈性成像技術(shù)、聲脈沖輻射力成像技術(shù)、磁共振彈性成像技術(shù)[22]在飛速進步。這些無創(chuàng)技術(shù)對于判斷有無肝纖維化和肝硬化有很大價值，卻難以精確區(qū)分相鄰兩級的肝纖維化。肝活檢仍然將在一段時間內(nèi)廣泛應(yīng)用于臨床實踐中，本研究的臨床意義仍不能被忽視。應(yīng)用Laennec組織病理學(xué)分級的肝臟組織病理學(xué)評價與HYP含量、臨床分期以及MELD評分均有顯著的相關(guān)性，這表明，組織病理學(xué)亞分類對肝硬化患者的診斷及預(yù)后判斷均可提供有力的證據(jù)。我們還將進一步擴大納入患者的數(shù)量，并對患者進一步長期的隨訪，了解患者并發(fā)癥的發(fā)生情況及生存情況。

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