李孜孜 周璇

術(shù)中快速冷凍切片制作相關(guān)問題探討

李孜孜 周璇

本文通過對取材、切片、染色、封片各個(gè)環(huán)節(jié)的分析, 闡述容易出現(xiàn)的問題及對策。通過針對不同組織切片對策的調(diào)整, 制作出優(yōu)質(zhì)的冰凍切片。制作術(shù)中冷凍切片的制作是一項(xiàng)需要謹(jǐn)慎的態(tài)度和高超的技巧的工作, 需要病理技術(shù)人員長期的練習(xí)和摸索, 并在實(shí)際工作中針對不同組織的特點(diǎn)采用不同的制片方式, 不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)問題及解決問題。

冷凍切片；制片

快速冷凍切片是新鮮組織不經(jīng)過任何脫水處理, 通過冷凍包埋劑的支持硬化, 直接在低溫恒冷切片機(jī)冷凍后立即進(jìn)行組織切片。未經(jīng)過固定的組織著色迅速, 色彩鮮艷, 并最大程度的保存了組織中酶的活性, 在臨床和科研中應(yīng)用廣泛。在臨床工作中, 由于冷凍切片制片時(shí)間短, 能在30～40 min內(nèi)為臨床醫(yī)師對患者制定手術(shù)治療方案提供依據(jù), 而常規(guī)石蠟切片的活體組織病理學(xué)診斷報(bào)告一般用于收到送檢標(biāo)本后的3～5個(gè)工作日才能發(fā)出, 在外科手術(shù)中得以廣泛的應(yīng)用,因此醫(yī)院的病理科冷凍切片的發(fā)展水平對于外科的發(fā)展起到了很大的支持作用［1］。但由于快速冷凍切片的組織未經(jīng)過固定, 形態(tài)和常規(guī)石蠟切片具有一定的差異, 所以該方法具有一定的局限性, 一些疑難病例的診斷和對腫瘤的進(jìn)一步分類,需要待石蠟切片結(jié)果而定?？焖倮鋬鲋破捎谥谱鲿r(shí)間短,要求在15 min之內(nèi), 因此對病理技術(shù)人員的技術(shù)及標(biāo)本的取材、快速冷凍切片機(jī)的溫度、包埋劑的支持硬化、防卷板的調(diào)試都有極高的要求。

1 材料與方法

1.1 一般材料 手術(shù)送檢皮膚、甲狀腺、胃腸、乳腺、淋巴結(jié)、子宮、卵巢、肺、前列腺、腦等組織, 所有組織均新鮮切除并不加任何處理。

1.2 試劑 普通膠水; AF混合固定液(95%乙醇90 ml、40%甲醛10 ml)、蘇木素染色液、水溶性伊紅及梯度乙醇、二甲苯。

1.3 設(shè)備及器材 德國產(chǎn)Le ica-CM1900型恒冷切片機(jī), 預(yù)先調(diào)至-22～-20℃；日本產(chǎn)Feather一次性刀片。

1.4 方法

1.4.1 取材 將手術(shù)送檢的組織按常規(guī)取材, 取材砧板保持干凈避免污染, 一般組織塊的大小為1.5 cm×1.5 cm ×(0.4～0.6 cm)。取材比常規(guī)石蠟活檢組織略厚, 取材時(shí)避開脂肪及壞死出血區(qū), 盡量剔除脂肪、毛發(fā)、硬骨或鈣化, 取材時(shí)注意干燥, 小組織用干紗布托住, 以防脫落。由于取材的塊數(shù)有限, 因此要求取材人員仔細(xì)檢查標(biāo)本, 針對病變區(qū)域重點(diǎn)取材。

1.4.2 包埋 將取好材塊最利于診斷切片向上, 放置于金屬冰托上, 冰托無需提前冷藏, 再放入冷凍切片機(jī)內(nèi),加膠水, 待凍結(jié)后, 并在周圍補(bǔ)以適當(dāng)膠水。對穿刺或較小的組織標(biāo)本, 先放少許膠水于切片托上做一冰臺, 墊高后再放小塊組織進(jìn)一步冰凍后再切。待組織周圍膠水完全凝固之后, 將冷凍錘輕壓在組織表面, 使組織和周圍的支撐劑平整。

相關(guān)文獻(xiàn)建議各種組織冰凍溫度如下：甲狀腺-20～-18℃；含脂肪的乳腺-30～-22℃；脂肪組織-30℃以下；腦-18～-16℃；肝、脾、腎、淋巴結(jié)-18℃；皮膚、肌肉-24～-22℃；卵巢、膽囊、胃壁-22～-20℃。在實(shí)際工作中, 由于白天術(shù)中冰凍標(biāo)本較密集, 頻繁調(diào)試切片機(jī)的溫度不實(shí)際, 故一般在室溫20℃以上時(shí)將冷凍切片機(jī)機(jī)箱溫度調(diào)至-25℃, 在室溫低于20℃時(shí)將冷凍切片機(jī)機(jī)箱溫度調(diào)至-20℃［2,3］。

1.4.3 切片 將金屬冰托夾至樣品夾, 緩慢倒退至合適距離開始修片, 修片不可進(jìn)刀幅度太大, 會(huì)使留片時(shí)刀頭前進(jìn)不均勻, 切片上產(chǎn)生橫紋。留片時(shí)均勻轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪, 適當(dāng)調(diào)整防卷板的位置, 留片厚度4～6 μm。

1.4.4 染色 將已固定的切片用風(fēng)筒吹干用流水沖洗后,先放入AF固定液固定1 min, 然后放入蘇木素染色液中染0.5～1.0 min, 取出水洗數(shù)秒, 用體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇分化,水洗后放入40～60℃體積分?jǐn)?shù)10%氨水中藍(lán)化。然后置入伊紅液染10 s, 水洗。體積分?jǐn)?shù)80%～100% 梯度乙醇脫水至二甲苯, 封固。

2 結(jié)果

經(jīng)過上述處理, 切片平整、厚薄均勻、無皺褶、細(xì)胞核呈藍(lán)色, 細(xì)胞質(zhì)呈紅色, 對比鮮艷清晰, 細(xì)胞無腫脹、無收縮,切片無冰晶, 與常規(guī)石蠟切片基本無差別。

3 容易出現(xiàn)的相關(guān)問題及對策

3.1 取材 冰托清理干凈殘留膠水, 定期用消毒試劑浸泡,晾干備用；含水或血分較多組織容易產(chǎn)生冰晶不利于切出完整切片, 在取材時(shí)應(yīng)用擦鏡紙吸取水分和血跡：取材時(shí)盡量避免脂肪和壞死組織；取材大小厚度適中, 組織塊太小不利于診斷、太大留片困難, 太厚冷凍時(shí)間長；取材時(shí)要特別留意細(xì)釘子和骨組織, 以免對切片機(jī)造成損壞［5,6］。

3.2 包埋 包埋時(shí)冰托不需預(yù)先冷凍, 避免冷凍劑和冰托由于溫差太大不能緊密結(jié)合；包埋用膠水要完全包裹組織。

3.3 切片 切片過程中根據(jù)組織不同的特點(diǎn)調(diào)整切片策略。①甲狀腺等組織可能由于冰凍時(shí)間過長產(chǎn)生碎片或條索狀,可以用拇指輕輕按壓組織數(shù)秒, 使組織塊溫度略升高再繼續(xù)留片。②乳腺等含脂肪含量較多的組織, 留片困難時(shí)可以適當(dāng)增加切片厚度。③組織塊較小或病變區(qū)域較小時(shí),修片幅度要小, 靠近所需區(qū)域時(shí)應(yīng)用轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪繼續(xù)修片, 直至最大面然后留片。④皮膚組織皮面向上切片。⑤切片皺在一起, 不能完整出片, 適當(dāng)調(diào)整防卷板和刀口的位置。⑥切片一截厚一截薄, 呈階梯狀, 這是由于組織過硬(如子宮肌瘤、宮頸或乳腺纖維腺瘤), 或由于切片機(jī)樣品夾頭和刀座上的螺絲沒有擰緊。⑦切片出現(xiàn)篩狀空洞時(shí), 是由于組織塊較硬修片進(jìn)刀幅度較大, 可繼續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪使組織塊上白點(diǎn)消失再留片。

3.4 染色 ①固定時(shí)間要充足, 固定液要經(jīng)常更換, 固定不充分的組織尤其是細(xì)胞成分較多, 組織在鏡下觀察時(shí)會(huì)出現(xiàn)流水樣改變。②染色不鮮明, 細(xì)胞漿細(xì)胞核不分明時(shí), 要立即更換蘇木素和伊紅。③染色之前切片一定要用風(fēng)筒吹干,否則易脫片。

3.5 封片 ①封片時(shí)的切片要充分干燥, 未充分干燥的切片鏡下呈水霧狀。②封片用樹脂濃度適宜, 利于將組織完全封固。

3. 6 冰余和冰對的處置 ①冰余在冰凍結(jié)果上報(bào)至手術(shù)醫(yī)生之后立即用福爾馬林固定, 避免時(shí)間太久組織自溶。②冰對可貼上病理號, 避免標(biāo)本混淆, 置于冰凍機(jī)中, 當(dāng)天不取材的冰余表面應(yīng)用膠水封固。

綜上所述, 制作術(shù)中冷凍切片的制作是一項(xiàng)需要謹(jǐn)慎的態(tài)度和高超的技巧的工作, 需要病理技術(shù)人員長期的練習(xí)和摸索, 并在實(shí)際工作中針對不同組織的特點(diǎn)采用不同的制片方式, 不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)問題及解決問題。這不僅體現(xiàn)了一名醫(yī)務(wù)者精益求精的態(tài)度更體現(xiàn)了一名醫(yī)務(wù)工作者的責(zé)任心。只有通過這樣不斷的努力和鉆研才能制作出精良的術(shù)中病理切片, 為病理診斷提供保障。

［1］ 邴魯軍, 高英茂, 郭雨霽, 等.冷凍切片常遇到的問題及解決對策. 醫(yī)學(xué)信息.2006(9):1631-1633.

［2］ 陳樂真, 于占洋. 提高冷凍切片診斷準(zhǔn)確性的經(jīng)驗(yàn)和體會(huì).中華病理學(xué)雜志.2000(2):59-61.

［3］ 董愉, 梁英杰, 吳惠群, 等. 不同固定液對不同組織冷凍切片HE染色效果的探討.臨床醫(yī)學(xué)工程.2011(10):1584-1585.

［4］ 許平, 王筱璨, 陳奎生, 等. 快速冰凍切片制備方法的改進(jìn).鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版).2010.45(2):241-243.

［5］ 劉曉蘭, 劉燕, 宋月晗, 等. 冰凍切片制作體會(huì)及常見問題.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2010.10(14):2737-2741.

［6］ 凌啟波, 梁英杰. HE制片質(zhì)控要求.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志.2000.16(4):333-334.

Investigation of related issues of making fast freezing microtome section in operation

LI Zi-zi, ZHOU Xuan.
The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Zhuha.519000, China

In this paper, problems and solutions were elaborated through the analysis of materials, sectioning, staining, and mounting. Quality frozen section was made through adjustment of different tissue slicing strategies. Making fast freezing microtome section in operation requires cautious attitude and excellent skill. Pathological technical staff needs long-term exercise and exploration, and they ought to take various making methods for different tissues with specific characteristics. It is necessary for them to summarize working experience for finding and solving questions.

Freezing microtome section; Section making

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.01.164

2014-09-01］

519000 中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院