李 楠, 趙吉元,2, 尹悅佳, 柳 青, 郭 嘉, 王云鵬, 劉相國(guó), 郝東云, 賀紅霞*

1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 長(zhǎng)春 130033;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118

玉米(ZeamaysL.)是世界栽培廣泛的三大作物之一，其產(chǎn)量高于水稻和小麥。玉米籽粒中最主要的成分是淀粉，占籽?？傊亓康?4%～78%，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。玉米直鏈淀粉比小麥、水稻、馬鈴薯等淀粉更適宜作為工業(yè)原料，由于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和物理特性，在醫(yī)藥、造紙、紡織、化工、可降解塑料、食品工業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[1～3],特別是近年來(lái)玉米作為化工和能源(乙醇)發(fā)酵生產(chǎn)的原料更加顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4,5]。玉米淀粉占全球總淀粉產(chǎn)量的80%，但普通玉米的直鏈淀粉含量約占總淀粉含量的25%，不能夠滿足工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的需求。隨著市場(chǎng)需求的不斷增加，高直鏈淀粉玉米(直鏈淀粉含量超過(guò)50%)因其產(chǎn)品產(chǎn)率高、生產(chǎn)成本低[6,7]，成為玉米品質(zhì)改良研究的熱點(diǎn)[8～12]。

玉米淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE) 是淀粉合成代謝調(diào)控中的關(guān)鍵酶，SBE 有 3 種同工酶：SBEⅠ、SBEⅡb 和 SBEⅡa，該酶的活性直接決定和影響著淀粉的結(jié)構(gòu)和組成，其中SBEⅡb對(duì)胚乳中直鏈淀粉含量的作用最大[13～15]，其編碼的amylose-extender(ae)突變使胚乳淀粉中支鏈淀粉含量下降而形成高直鏈淀粉胚乳[16]；而編碼 ISA 的sugary1(su1)突變使淀粉含量降低糖含量升高而形成甜玉米[17]。利用基因工程技術(shù)和RNA沉默技術(shù)相結(jié)合調(diào)控SBEⅡb的表達(dá)，可以獲得高直鏈淀粉玉米品種，前人已有很多報(bào)道通過(guò)正義序列、反義序列和發(fā)卡結(jié)構(gòu)抑制SBE的表達(dá)[4,5,7,18～25]。其中郭新梅等利用發(fā)卡結(jié)構(gòu)先后沉默SBEⅡ[22]和SBEⅠ基因[23]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SBEⅠ基因的沉默對(duì)直鏈淀粉含量的提高有一定的貢獻(xiàn)，但提高幅度較??；而SBEⅡb啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SBEⅡb反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)基因玉米T1材料籽粒中，直鏈淀粉含量增加了15.6%。柴曉杰等[18]應(yīng)用反義RNA和RNAi技術(shù)，抑制了玉米淀粉分支酶SBEⅡb基因的表達(dá)，使支鏈淀粉的合成降低，直鏈淀粉含量提高了約50%，而總淀粉含量基本沒(méi)有改變。

基因沉默 (gene silencing) 現(xiàn)象廣泛存在于生物中，與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)成為一種研究植物基因功能和表達(dá)調(diào)控的有效途徑[26～34]。自2001年報(bào)道自我互補(bǔ)的發(fā)夾 (hpRNA) 結(jié)構(gòu)在植物上會(huì)產(chǎn)生有效的基因沉默現(xiàn)象以來(lái)[35]，這一技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。當(dāng)內(nèi)含子成為發(fā)夾結(jié)構(gòu)中反向重復(fù)序列中間的核酸序列時(shí)，基因沉默效率很高，這種結(jié)構(gòu)稱為 ihpRNA[36]。本研究克隆了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb片段，構(gòu)建了具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的ihpRNA載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入玉米受體HiII幼胚中，降低了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的表達(dá)，減少了支鏈淀粉的合成，進(jìn)而使直鏈淀粉含量增加，以期為創(chuàng)制和利用高直鏈淀粉的玉米種質(zhì)資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金公司，農(nóng)桿菌菌株EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存，玉米B73和受體品種HiII由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供。限制性內(nèi)切酶、去磷酸化酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，pGEM-T載體購(gòu)自Promega公司。Taq酶購(gòu)自TaKaRa公司，pTF101.1-ubi載體為自主構(gòu)建。克隆載體pHANNIBAL為澳大利亞的Waterhouse實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)[35]。Bar試紙條檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海佑隆生物科技有限公司。組織培養(yǎng)中的基本培養(yǎng)基和抗生素購(gòu)自PhytoTechnology公司，篩選劑雙丙氨膦購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司，其他藥品購(gòu)自Sigma公司。

1.2 引物序列

本研究所用的引物根據(jù)Primer 5.0設(shè)計(jì)，引物序列由上海捷瑞公司合成，具體序列信息見(jiàn)表1。

1.3 玉米淀粉分支酶ZmSBEⅡb基因的克隆

玉米R(shí)NA 的提取按照試劑盒(Promega, RNAIsolation System Kit)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RT-PCR所用引物根據(jù)已發(fā)表序列AF072725設(shè)計(jì)并進(jìn)行了改造(表1)，擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。擴(kuò)增所得片段連入pGEM-T載體，測(cè)序分析所得片段長(zhǎng)度為2 400 bp。SBEⅡb基因片段通過(guò)EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)連接于載體pGBKT7，得到重組載體pGBKT7-SBEⅡb。

1.4 用于構(gòu)建ihpRNA載體目的片段的PCR擴(kuò)增

利用pGBK7-SBEⅡb質(zhì)粒DNA做模板，所用引物和反應(yīng)條件見(jiàn)表1。分別擴(kuò)增出帶有不同酶切位點(diǎn)的SBEⅡb-F和SBEⅡb-R。將擴(kuò)增的PCR片段連入pGEM-T載體中，經(jīng)測(cè)序分析無(wú)誤后，利用XhoⅠ和KpnⅠ分別雙酶切pGEM-TSBEⅡb-F和pHANNIBAL，回收目的片段SBEⅡb-F和載體片段，連接得到重組載體pHAN-SBEⅡb-F。之后用XbaⅠ和HindⅢ分別雙酶切pGEM-TSBEⅡb-R和pHAN-SBEⅡb-F，回收目的片段SBEⅡb-R和載體片段，重組連接得到pHAN-SBEⅡbhairpin。

表1 本研究所用的引物序列及反應(yīng)條件Table 1 Primer sequences used in this study and its annealing temperature.

1.5 SBEⅡb基因沉默載體的構(gòu)建

利用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切pHAN-SBEⅡbhairpin回收發(fā)卡結(jié)構(gòu)，利用NEB平末端修飾試劑盒進(jìn)行平末端處理，將修飾過(guò)的片段插入SmaⅠ單酶切去磷酸化處理的pTF101.1-ubi載體中，連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌TransT1，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。從平板上挑取單菌落進(jìn)行PCR 與酶切鑒定、回收、純化陽(yáng)性克隆目的片段。得到重組載體即為pTFU-SBEⅡbhairpin。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化

含有pTFU-SBEⅡbhairpin的農(nóng)桿菌EHA105在YEP固體培養(yǎng)基上涂布，28℃下暗培養(yǎng)1～3 d。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌從平板上刮下重懸，調(diào)OD550至0.3，制成侵染液。取授粉后9～12 d的玉米HiII幼穗，剝?nèi)∮着哂谇秩疽褐薪? min。侵染結(jié)束后，幼胚盾片朝上接種于共培養(yǎng)基中，20℃暗培養(yǎng)3 d。轉(zhuǎn)至靜息培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)7 d。再轉(zhuǎn)至含有1.5 mg/L雙丙氨膦的選擇培養(yǎng)基Ⅰ中，28℃暗培養(yǎng)2周。如已得到初始愈傷組織，將其轉(zhuǎn)至含有3 mg/L雙丙氨膦的篩選培養(yǎng)基Ⅱ中，28℃暗培養(yǎng)2周，以后每?jī)芍芨鼡Q一次篩選培養(yǎng)基Ⅱ。

當(dāng)篩選得到的抗性愈傷組織增殖至直徑2 cm左右時(shí)，將其轉(zhuǎn)至暗分化培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)2～3周。將分化得到的胚芽鞘轉(zhuǎn)至光分化培養(yǎng)基上，25℃光下培養(yǎng)2周。待胚芽鞘形成完整的幼苗和根，將幼苗轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中促根壯苗。10 d后將幼苗移栽入營(yíng)養(yǎng)缽，溫室中培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)出1～2片新葉后移入大花盆，轉(zhuǎn)移至大型溫室，以后按照常規(guī)方法進(jìn)行日常管理即可(所用到的培養(yǎng)基配方見(jiàn)表2)。

1.7 T1代轉(zhuǎn)基因植株的篩選

利用傳統(tǒng)的CTAB法提取玉米三葉期葉片基因組DNA，根據(jù)植物表達(dá)載體上帶有的Bar篩選標(biāo)記設(shè)計(jì)引物(表1)，按照表1中PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR鑒定。篩選出的陽(yáng)性植株再進(jìn)行Bar試紙條檢測(cè)，雙重驗(yàn)證陽(yáng)性的植株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米SBEⅡb的表達(dá)

分別提取檢測(cè)陰性與陽(yáng)性玉米植株三葉期葉片的總RNA，利用Thermo的反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得第一條cDNA鏈，利用核酸濃度測(cè)定儀對(duì)不同樣品的cDNA濃度進(jìn)行定量，之后在SBEⅡb基因的CDS區(qū)設(shè)計(jì)可擴(kuò)增出大小為411 bp的引物(表1)，以玉米EF-1A為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為213 bp。以cDNA為模版，以檢測(cè)陰性為對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株SBEⅡb基因的表達(dá)量進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆與序列分析

以重組載體pGBKT7-SBEⅡb質(zhì)粒DNA為模板，分別用帶有不同酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為433 bp的DNA片段(圖1)。將得到的片段與pGEM-T載體連接，分別得到pGEM-TSBEⅡb-F和pGEM-TSBEⅡb-R。測(cè)序分析結(jié)果正確。

表2 遺傳轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基配方Table 2 The components of medium used in maize transformation.

圖1 SBEⅡb正向片段和反向片段的PCR克隆Fig.1 Cloning of SBEⅡb forward fragment and reverse fragment.M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1,2:SBEⅡb正向克隆片段；3,4:SBEⅡb反向克隆片段。

2.2 SBEⅡb基因沉默載體pTFU-SBEⅡb hairpin的構(gòu)建

利用酶切連接方法將正向片段和反向片段分別插入pHANNIBAL中，得到含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的pHAN-SBEⅡbhairpin。

利用酶切、平末端化、去磷酸化及連接技術(shù)將SBEⅡbhairpin結(jié)構(gòu)插入植物表達(dá)載體pTF101.1-ubi中，經(jīng)PCR擴(kuò)增(圖2A)及酶切驗(yàn)證(圖2B)結(jié)果確定得到重組載體pTFU-SBEⅡbhairpin(圖2C)。

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

本研究采用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化玉米品種HiII的幼胚434個(gè)，獲得抗性愈傷組織5個(gè)，轉(zhuǎn)化率為1.15%。移栽溫室轉(zhuǎn)化苗194株，其中4株(覆蓋2個(gè)轉(zhuǎn)化事件)結(jié)實(shí)，獲得轉(zhuǎn)SBEⅡbhairpin基因種子35粒。

2.4 T1代轉(zhuǎn)基因植株的篩選

取轉(zhuǎn)基因種子11粒，播種到溫室花盆中，在三葉期提取基因組DNA，檢測(cè)11株材料中3株Bar基因擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性(圖3A)，為了檢測(cè)這3株陽(yáng)性材料中PAT/bar蛋白表達(dá)情況，利用QuickStix試紙條(購(gòu)自上海佑隆生物科技公司)進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明操作，結(jié)果表明所得PCR陽(yáng)性材料經(jīng)試紙條驗(yàn)證均為陽(yáng)性，即獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性材料(圖3B)。

2.5 轉(zhuǎn)基因玉米SBEⅡb的表達(dá)分析

半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因材料48-3中的SBEⅡb基因的表達(dá)明顯受到干擾，幾乎沒(méi)有表達(dá)(圖4)。證明所構(gòu)建的發(fā)卡結(jié)構(gòu)已經(jīng)起到RNA干擾的作用，抑制了SBEⅡb基因的表達(dá)。

圖2 pTFU-SBEⅡb hairpin載體驗(yàn)證及圖譜Fig.2 Map of pTFU-SBEⅡb hairpin.A.重組載體pTFU-SBEⅡb hairpin的PCR擴(kuò)增：M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，CK-:陰性對(duì)照，1～4:為重組的pTFU-SBEⅡb hairpin；B.重組載體pTFU-SBEⅡb hairpin的酶切鑒定：M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DL5000，1～4:HindⅢ單酶切；C.重組的pTFU-SBEⅡb載體圖譜。

圖3 轉(zhuǎn)基因玉米T1代植株的分子檢測(cè)Fig.3 Molecular analysis of transgenic maize T1 generation.A. 轉(zhuǎn)基因材料中Bar基因的PCR擴(kuò)增：M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、2和3分別為轉(zhuǎn)基因植株48-1、48-2和48-3，目的片段Bar為352bp；B.轉(zhuǎn)基因材料中Bar蛋白的試紙條檢測(cè)：47-3為陰性材料，48-1、48-2和48-3為陽(yáng)性材料。

2.6 SBEⅡb基因RNA干擾對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米表型的影響

將RNA干擾植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入玉米后，獲得的轉(zhuǎn)基因T1代籽粒表型出現(xiàn)明顯的皺縮，籽粒偏小，轉(zhuǎn)基因受體材料(圖5A，彩圖見(jiàn)封三圖版)明顯比轉(zhuǎn)基因材料飽滿，預(yù)計(jì)淀粉含量高于轉(zhuǎn)基因材料(圖5B)。從植株的表型可看出，陰性材料(圖5C)的植株長(zhǎng)勢(shì)明顯好于轉(zhuǎn)基因植株(圖5D)，轉(zhuǎn)基因植株存活率低，長(zhǎng)至八葉期前后出現(xiàn)枯黃，隨后死亡，存活植株與陰性材料植株相比，株高矮小。

圖4 半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中SBEⅡb的表達(dá)Fig.4 The expression of SBEⅡb in transgenic maize by semi-quantitative RT-PCR.M: DL2000, 擴(kuò)增基因分別為：A：內(nèi)參EF-1A；B：SBEⅡb。

圖5 轉(zhuǎn)基因玉米T1代種子及植株與野生型的差異Fig.5 Differences between T1 seeds and seedling of transgenic maize and wild type.A:為野生型籽粒；B:轉(zhuǎn)SBEⅡb hairpin基因的T1代種子；C:野生型植株；D:轉(zhuǎn)SBEⅡb hairpin基因的T1代植株。(彩圖見(jiàn)封三圖版)

3 討論

本研究成功構(gòu)建了帶有組成型啟動(dòng)子的沉默玉米淀粉分支酶SBEⅡb的ihp載體pTFU-SBEⅡbhairpin，用組成型啟動(dòng)子沉默玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb，外源基因SBEⅡb的表達(dá)在受體植物的所有部位、各個(gè)時(shí)期都受到明顯的抑制。其中胚乳淀粉含量的劇烈改變說(shuō)明SBEⅡb基因在胚乳發(fā)育階段淀粉合成代謝中發(fā)揮重要的作用。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是：按照經(jīng)典的淀粉合成代謝途徑分析，淀粉合成時(shí)，淀粉分支酶和淀粉合成酶分別負(fù)責(zé)支鏈和直鏈的延伸，當(dāng)阻斷分支酶活性時(shí)，淀粉代謝向直鏈淀粉合成方向轉(zhuǎn)換，最終基礎(chǔ)底物蔗糖全部轉(zhuǎn)換為直鏈淀粉。根據(jù)物質(zhì)守恒定律，如果基礎(chǔ)蔗糖底物總量不變，淀粉含量應(yīng)該不變。然而，我們研究發(fā)現(xiàn)抑制淀粉分支酶SBEⅡb的活性，一定程度上導(dǎo)致直鏈淀粉的增加，但是最大影響是轉(zhuǎn)基因玉米種子表型出現(xiàn)明顯的皺縮，即總淀粉含量劇烈下降，這表明SBEⅡb不僅僅直接參與合成支鏈淀粉，也可能參與總淀粉的合成調(diào)控。最近的研究表明淀粉合成過(guò)程存在多個(gè)淀粉結(jié)合型多酶復(fù)合物(未發(fā)表數(shù)據(jù))，蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控淀粉代謝的代謝流轉(zhuǎn)換。 Hennen-Bierwagen等[37]的報(bào)道同樣表明SBEⅡb存在于多酶復(fù)合物當(dāng)中。 綜上，我們認(rèn)為當(dāng)SBEⅡb被沉默后，多酶復(fù)合物的成分出現(xiàn)變化，代謝流轉(zhuǎn)換的同時(shí)，代謝速率也明顯改變，主要表現(xiàn)為合成淀粉速度減慢，最終導(dǎo)致玉米淀粉含量減少。關(guān)于復(fù)雜的淀粉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需要進(jìn)一步的研究。

另一個(gè)值得關(guān)注的現(xiàn)象是SBEⅡb的表達(dá)受到了抑制時(shí)，植株生長(zhǎng)受限，結(jié)實(shí)率極低，這表明SBEⅡb基因不僅在玉米胚乳淀粉代謝中起關(guān)鍵作用，在植株生長(zhǎng)過(guò)程中也發(fā)揮重要的生理作用。今后研究中我們可以嘗試改進(jìn)方法采用組織特異性啟動(dòng)子，在特定部位特定時(shí)期抑制SBEⅡb的活性，更有助于提高籽粒中直鏈淀粉的含量，改善植株生長(zhǎng)狀況。

綜上，本研究采用組成型表達(dá)帶有內(nèi)含子的發(fā)卡結(jié)構(gòu)研究策略，成功的抑制了轉(zhuǎn)基因玉米中淀粉分支酶基因SBEⅡb的表達(dá)。研究證實(shí)SBEⅡb不但直接參與支鏈淀粉的合成代謝，還在胚乳總淀粉含量和植株生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為詳細(xì)解析復(fù)雜多酶復(fù)合物調(diào)控過(guò)程提供了基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)，對(duì)進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法獲得高產(chǎn)高直鏈玉米新種質(zhì)的研究提供了新的啟示。

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