熊軍波++劉洋++蔡化++田宏++張鶴山

摘要：紫花苜蓿是全球栽培面積最大的多年生豆科牧草，鋁毒是制約其在酸性土壤推廣種植的主要因子之一。主要綜述了紫花苜蓿鋁毒害機理、抗鋁品種選育、抗鋁生理生化、抗鋁的分子機理以及抗鋁的轉基因研究等方面的主要進展，并對紫花苜蓿耐鋁性研究中存在的問題和前景進行了討論。

關鍵詞：紫花苜蓿；鋁毒；品種選育；抗性基因

中圖分類號：S54 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2014）11-0079-05

紫花苜蓿（Medicago sativ L.）是全球栽培面積最大的多年生豆科牧草，具有高產優(yōu)質等特性，是公認的“牧草之王”。紫花苜蓿適宜生長在 pH 6.7～7.5的土壤環(huán)境中，當土壤pH低于6.7時，苜蓿產量會隨著pH的下降而迅速下降[1]。據統(tǒng)計，世界范圍內有超過40%的可耕作土地呈酸性[2]。我國長江以南廣泛地分布著大面積的酸性土壤， 主要集中在浙江、江西、福建、廣東、廣西、海南、云南和貴州等南方省份， 總面積達2.04億hm2，約占全國耕地面積的21%[3]。如何提高紫花苜蓿在酸性土壤中的產量，一直是國內外苜蓿工作者關注的重點。2001年美國農業(yè)部已將耐酸性苜蓿研究列為科研課題，我國也有相關項目已啟動。

酸性土壤中作物減產主要由鋁毒造成。近年來，國內外圍繞紫花苜?？逛X毒進行了大量研究，主要集中在鋁毒害機理、紫花苜蓿耐鋁品種選育、耐鋁性生理生化、耐鋁分子機理及耐酸鋁轉基因研究等方面。筆者圍繞這幾方面對紫花苜蓿耐鋁毒特性研究進展進行了綜述，旨在為今后的研究工作提供參考。

1 鋁的毒害機理

鋁是地球上含量最高的金屬元素，在中性或堿性土壤溶液中，鋁主要以不溶性的硅酸鹽和氧化物形式存在，對植物生長無危害；但當土壤環(huán)境呈酸性時，鋁以離子態(tài)[Al（OH）2+、Al（OH）2+、Al3+、 Al（H20）63+]釋放到溶液中[4]。一方面，酸性土壤中鋁離子溶出占土壤中陽離子交換總量的20%～80%，導致其他土壤陽離子的吸附或流失， 造成鉀、磷、鈣和鉬等營養(yǎng)元素的缺乏；另一方面，鋁離子對植物生長產生毒害作用。研究表明，酸性土壤中作物減產67%是由鋁毒造成[5]。

紫花苜蓿屬鋁毒極端敏感植物，高于0.1mmol/L的鋁離子處理能明顯降低苜蓿種子的發(fā)芽數量、速度和質量，抑制幼苗生長，其可能機制是A13+處理影響苜蓿種子萌發(fā)時主要貯藏物質蛋白質的轉化、根細胞膜的選擇透過性和葉片的光合作用[6]。根系吸收到鋁離子在體內移動很小，主要分布在老根中，通過間接作用抑制新根系生長，導致次生根畸形分支、腫脹和數量減少，降低了水分和營養(yǎng)元素的吸收[7]。此外，鋁離子通過影響根瘤菌和苜蓿相互識別過程中結瘤信號——結瘤因子的傳遞，導致根瘤生成減少，對根瘤菌固氮產生影響，從而使苜蓿的產量下降[8]。

農業(yè)生產中采用施生石灰對酸性土壤進行改良效果顯著，但是該方法的成本較高，且改善的土壤主要集中在地表，土層深處的土壤依然是酸性，改良的效果有限。此外也有研究表明，鈣、磷對紫花苜蓿根瘤菌體系酸鋁脅迫有一定修復效應，但長期施用化肥會影響土壤團粒結構，導致板結。因此，在采用各種外源措施提高酸性土壤中苜蓿產量的同時，還須考慮紫花苜蓿自身的因素，充分挖掘其潛力，通過遺傳改良來獲得抗鋁毒能力強的品種，這是持續(xù)、高效解決酸性土壤中鋁毒害的有效途徑。

2 紫花苜蓿耐酸鋁鑒定和品種選育

對種質資源開展抗性鑒定是遺傳改良和品種選育的基礎，國內外研究者采用不同鑒定體系對紫花苜蓿種質資源抗鋁性展開了鑒定。Bouton [9]采用水培法對美國農業(yè)部192 份核心紫花苜蓿種質進行了耐鋁性鑒定，比較鋁脅迫下根系的伸長率，發(fā)現4%的苜蓿種質根相對生長量顯著高于GA-AT， 35%則顯著低于GA-AT。李海慶等[10]對國內外79份苜蓿種質進行了耐鋁鑒定，結果表明這些種質在鋁脅迫下根相對生長量減少69.6%～3.2%不等。邱曉等[11]對27個紫花苜蓿品種耐鋁性進行了評價，根據測定，將這些品種分為了四類。Pan等[12]對13個紫花苜蓿品種耐鋁性進行了鑒定，結果表明鋁脅迫下，13品種在相對根長，相對發(fā)芽率，相對下胚軸長度，相對鮮重和生根性等方面都存在差異性。此外，還有大量針對小批量苜蓿篩選的報道，結果都證實了苜蓿的耐鋁性存在遺傳多樣性。

紫花苜蓿種質在抗鋁性上存在顯著的遺傳多樣性，且紫花苜蓿耐鋁遺傳性表現為一般配合力[13， 14]。因此，理論上通過多世代表型輪回選擇可以選育抗鋁毒性狀好的品種。采用傳統(tǒng)的輪回選擇法，美國喬治亞大學的Bouton 團隊培育出了目前公認最耐鋁毒的苜蓿品種GA-AT，其抗鋁毒能力顯著高于美國農業(yè)部（U.S. Department of Agriculture，USDA）種子資源庫收集的所有紫花苜蓿核心種質資源[9]。但這一品種并沒有得到大面積推廣，其主要原因是經濟效益遠落后于采用施生石灰后種植紫花苜蓿所獲得的收益。這表明，傳統(tǒng)的表型輪回選擇法在提高紫花苜?？逛X性方面效果不顯著。一方面，紫花苜蓿種質資源中缺乏抗鋁毒性狀突出的種質；另一方面，紫花苜蓿栽培種屬于四倍體植物，其雜交優(yōu)勢和自交退化可能掩蓋了抗鋁基因的表達，導致種質分子遺傳水平的異質性和表型間缺乏對應關系，致使特異抗鋁性狀難以通過表型選擇實現。也有學者嘗試采用組織培養(yǎng)篩選耐鋁突變單細胞來提高紫花苜蓿的抗鋁性，最終也未能取得突變，其主要原因是組織培養(yǎng)過程中出現的突變是隨機的，且單細胞再生植株的抗鋁性與單細胞的抗鋁性關聯(lián)不強[15， 16]。

3 紫花苜蓿耐酸鋁分子機理

3.1 抗鋁分子標記

從生理研究和遺傳分析中得出的多數結果都表明紫花苜蓿耐鋁毒性狀是受多個基因控制的數量性狀。隨著分子標記技術的成熟和應用，對紫花苜蓿耐鋁毒進行數量性狀基因座（Quantitative trait locus，QTL）的定位和分子標記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）成為可能。 Sledge等[17，18]以野生型二倍體苜蓿（M.sativa ssp.coerulea coerulea）與四倍體紫花苜蓿（M.sativa ssp）雜交群體為材料，采用限制性內切酶多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）標記技術，對紫花苜蓿耐鋁性狀進行了QTL定位研究。研究中共選取了146個探針對親本進行篩選，其中58個作圖探針定位于9個連鎖群，且有9個表現為非連鎖的獨立遺傳。最終發(fā)現4個標記（UGAC141、UGAC782、UGAC053、UGAC44）與耐鋁性有關，其中UGAC44影響最大，占耐鋁性變異影響參數的15%；隨后又利用分子標記定位M.sativa ssp.Coerulea F2代與耐鋁相關的QTLs，發(fā)現兩個與耐鋁相關的RFLP標記（UGAc471和UGAc502）。Narasmhamoorthy等[19]用M.sativa ssp.Coerulea為材料，使用SSR標記鑒定了抗鋁數量性狀位點QTLs，發(fā)現了3個區(qū)域與耐鋁脅迫相關，分別在1號，2號和3號染色體上[19]。Khu等以Altet-4（耐鋁基因型） 和NECS-141（鋁敏基因型）兩個紫花苜蓿雜交群體為材料，選用SSR標記進行分析，將耐鋁基因定位于1，4，7三個連鎖群，其分別可以解釋20.8%，15.2% 和21.7%的變異。整體來說，目前的研究定位精度不夠，定位的QTL的值信區(qū)域過大，無法確定檢測到的一個QTL中是否包含有一個效應加大的基因還是幾個微效基因。其主要原因是栽培紫花苜蓿為同源四倍體，基因組復雜，導致種質材料分子遺傳水平的異質性和表型間缺乏明確對應關系。

3.2 抗鋁基因研究

植物抗鋁毒調節(jié)涉及到一個以上的基因，這些基因作為一個統(tǒng)一的整體進行調節(jié)，并可按照一定的時間順序組成基因表達通路或基因調節(jié)網絡，利用高通量分析技術從基因組學水平進行分析，可以幫助繪制相關基因作用通路或網圖，發(fā)掘特異性表達基因。采用抑制性差減雜交（Suppression Subtractive hybridization，SSH）技術，國內研究者建立了紫花苜蓿響應鋁脅迫的差異表達基因庫，獲取了一批鋁誘導差異表達基因。夏卓盛等[21]以抗鋁毒性較強苜蓿種質為材料構建了鋁脅迫SSH文庫，獲取了34個與鋁脅迫相關的EST 序列，25個EST與GenBank中其他序列具有同源性，9個EST未找到相似性較高序列。這些蛋白涉及到植物體的抗氧化作用、信號傳導、發(fā)育和能量代謝等多種生理過程。樊奇等[22]以中苜一號幼苗為材料，構建了紫花苜蓿鋁脅迫抑制消減文庫，其中包含456個克隆，隨機選取20個陽性克隆測序，共獲得15條有效EST序列和3條未知基因序列。這些都能為潛在的耐鋁基因源克隆和利用提供了基礎。

紫花苜蓿近親-蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn.）因具有生長期短、二倍體、基因組小、遺傳轉化效率高、自花授粉、固氮等特點，是世界公認的研究豆科生物學和基因組學的理想模式植物[23，24]。Chandran等[25]采用基因芯片技術研究敏鋁型蒺藜苜蓿Jemalong A17鋁脅迫下轉錄組的變化。結果表明，有2 782個基因表達量發(fā)生變化，其中591個表達量發(fā)生兩倍以上變化。對這些基因的功能分析表明，表達上調的基因大多與細胞壁修飾、生物和非生物脅迫應激相關，而表達量下調的基因大多與初生代謝、次生代謝以及蛋白質生物合成和折疊相關。值得關注的是研究中發(fā)現部分新基因，這些基因與細胞壁修飾、乙烯合成、有機酸轉運、維持鈣動態(tài)平衡相關。后續(xù)利用RNAi技術對基因功能進行驗證，發(fā)現一個參與果膠修飾基因，其低水平表達能顯著減少A1吸附到苜蓿毛狀根。由于研究中僅選用了一種蒺藜苜蓿材料，很難區(qū)分哪些基因是特定的受鋁誘導基因，因為本研究獲取的大部分基因也受其他條件的誘導，如：其他金屬毒害、鈣缺乏、受傷以及病蟲害侵襲等。此后，Chandran等采用基因芯片比較了兩份耐酸鋁能力存在差異的蒺藜苜蓿材料在響應鋁脅迫過程中轉錄組的差異表達，結果表明，抗鋁性和敏鋁性材料在轉錄組的差異主要體現在抗氧化脅迫的基因表達方面，抗性材料有更多抗氧化脅迫基因表達量上升，這有助于減少由吸收鋁離子而引起的氧化傷害。結果還表明在鋁誘導下兩種材料中MtMATE基因表達量都急劇上升，但在鋁敏型種質中主要在韌皮部表達，而抗鋁型種質中則主要在導管中表達。MATE基因屬于多藥和有毒化合物排出跨膜蛋白家族（Multidrug and toxic compound exudation ，MATE）成員，受鋁誘導激活，通過特異地往細胞以外轉運檸檬酸，螯合細胞外的鋁離子而發(fā)揮抗鋁毒作用，進而推測耐鋁型苜蓿通過將檸檬酸-鋁的結合體轉運到地上部分以減少鋁對根系的毒害，而敏鋁型則通過分泌檸檬酸來降低鋁離子毒害[26]。Chen等[27]利用高通量測序技術篩選酸鋁誘導miRNA，獲取了23個鋁誘miRNAs，對這些miRNA表達模式分析表明，大部分miRNA在短時間脅迫后就迅速表達，功能分析表明，這些miRNA調控的RNA主要與根的伸長，抗脅迫蛋白的合成等相關。姜格格等[28]采用全基因組關聯(lián)分析方法，篩選出58個與蒺藜苜蓿耐酸鋁性狀相關的SNP標記，這些SNP位點主要參與細胞壁合成、脂質代謝、環(huán)境脅迫響應過程、氧化還原反應過程以及小分子轉運等過程。Campbell等在比較兩個鋁敏性不同的紫花苜蓿根響應鋁脅迫的蛋白組研究時發(fā)現，耐鋁型苜蓿品種產生一個18.7kD蛋白質條帶，而鋁敏品種卻沒有，當時的分離技術手段和鑒定技術都較為落后，后續(xù)研究未能繼續(xù)展開[29]。

3.3 抗鋁基因工程研究

利用重組DNA技術和植物細胞全能性相結合，在體外操作基因，將外源基因轉入植物細胞，再生出轉基因植株，從而開創(chuàng)了遺傳改良的新途徑。近年來越來越多的研究結果已經表明，誘導根系合成和分泌有機酸是一些耐鋁種或品種抵御鋁毒的主要機制，有機酸合成和分泌調控基因的研究成為了抗鋁研究的重點。Langer等[30]研究發(fā)現，鋁脅迫下紫花苜蓿根系檸檬酸和琥珀酸分泌顯著增加，其分泌量與鋁離子濃度成正相關。目前紫花苜蓿中部分與有機酸合成和分泌相關的基因成功克隆。Miller等[31]從紫花苜蓿乙醛酸循環(huán)體、葉綠體、細胞質體、線粒體和根瘤體中克隆出5個蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrognase，MDH） 同工酶基因，其中根瘤體的MDH（Nodule-enhanced Malate dehydrognase，neMDH） 基因表達量和蛋白活性最高。烏艷紅等從紫花苜蓿中克隆了鋁激活蘋果酸轉運蛋白基因（Aluminum-activated malate transporter protein，MsALMT1），該基因參與蘋果酸的跨膜轉運[32]。靳苗苗等克隆了檸檬酸合成關鍵酶-檸檬酸合酶基因（Citrate synthase，MsCS）。Chandran等[26]從蒺藜苜蓿中克隆獲得檸檬酸轉運相關的通道蛋白基因（Multidrug and toxic compound exudation ，MtMATE）。

1986年，Deak等首次采用根癌農桿菌介導的方法獲得了轉基因苜蓿，為紫花苜蓿轉基因研究奠定了基礎。通過轉基因技術手段提高抗鋁性也成為國內外研究的重點。Fuente等1997 首次采用轉基因手段將細菌（Pseudomonas aeruginosa）的檸檬酸合成酶基因在煙草‘Xanthi體內過量表達，結果植株抗鋁能力得到提高。這表明，通過調控有機酸合成基因的表達可能是調控抗鋁性的重要途徑。Barone等[34]將綠膿桿菌中克隆的檸檬酸合酶轉入苜蓿誘導超表達，顯著提高了苜蓿根在酸鋁條件下的生長性。Tesfaye等[35]和羅小英等[36]將根瘤增強蘋果酸脫氫酶基因轉入苜蓿誘導超表達，顯著提高了苜蓿根在酸鋁條件下的生長性。劉嘉等證明將源于大腸桿菌的光誘導型蘋果酸脫氫酶基因轉入紫花苜蓿能一定程度提高苜蓿耐鋁性。

這些研究證實了轉基因苜蓿的根能更好的生長在含鋁的酸性土壤中，但目前所獲得的轉基因苜蓿在綜合提高抗鋁毒性能力方面非常有限。目前對紫花苜蓿抗鋁毒分子機理的了解非常有限，轉基因主要是通過改變苜蓿體內有機酸代謝和分泌的相關酶類的活性來創(chuàng)造轉基因植株，但植物存在多種抗鋁機制，不同植物種類或同一植物的不同品種在抗鋁機制上都存在差異，且有機酸的分泌只是其中一種。在大豆（Glycine max），玉米（Zea mays）及蕎麥（Fagopyrum esculentum）上的研究表明，有機酸分泌并不是種內抗鋁性差異的主要機制[38-40]。Howard等[30]研究也發(fā)現有機酸的分泌差異并不能完全解釋不同紫花苜蓿在耐鋁性上存在的差異。Tesfaye等[41]發(fā)現耐鋁性紫花苜蓿GA–AT和轉neMDH基因紫花苜蓿在耐鋁能力上相似，但是在有機酸的合成和分泌模式上卻存在顯著差異。Chandran等[26]對不同鋁敏型蒺藜苜蓿進行生理研究發(fā)現，耐鋁型種質鋁積累的根表皮細胞降解的速度要快于敏感型材料，表明耐鋁性與根表皮細胞的降解相關。因此，要通過轉基因手段提高紫花苜?？逛X性還必須建立明確其抗鋁分子機制的基礎上，探索更有效的工具基因。

4 結語

紫花苜蓿作為全球最重要的優(yōu)良豆科牧草，對畜牧業(yè)的發(fā)展以及生態(tài)環(huán)境的改善起著重要作用，但抗酸鋁能力差限制了其在我國南方的種植，提高紫花苜蓿在酸鋁性土壤中產量是苜蓿研究者需解決的問題。通過工程手段中和土壤酸性是目前最有效的方法，但是從長遠的角度考慮還須充分挖掘紫花苜蓿自身潛力，通過遺傳改良來獲得抗鋁毒能力強的品種。紫花苜蓿種質資源在抗酸鋁性上存在差異性，但是缺乏特異性抗酸鋁能力強的材料，且異花授粉的同源四倍體特性，導致傳統(tǒng)的雜交育種進展緩慢。通過基因工程技術改良苜?？顾徜X性已在國內外展開，在一定程度上提高了紫花苜蓿抗鋁性，但這些研究都是處于探索階段，離最終獲得抗逆高產的目標還有差距。由于植物的耐鋁性是一個受多基因控制的數量性狀，目前的研究多少基于單基因的轉化，這可能是限制基因工程耐鋁育種發(fā)展的原因之一。此外，人們對紫花苜蓿的抗酸鋁調節(jié)機制仍不完全清楚，這正是限制獲得耐鋁性強的新品種的主要障礙。

近年來，各種模式植物基因組測序相繼完成，大量基因功能得到闡明，這為利用模式物種信息進行栽培作物的改良奠定了良好的基礎。紫花苜蓿近親-蒺藜苜蓿是世界公認的研究豆科生物學和基因組學的理想模式植物[23， 24]。目前蒺藜苜蓿全基因組測序工作已進入尾聲，94%基因測序已完成，且大量基因的注釋工作也以完成，這為各種高通量功能基因組學技術研究奠定了堅實基礎[42]。比較基因組學研究證實，蒺藜苜蓿與紫花苜蓿有保守性非常高的共線性關系，因此從蒺藜苜蓿獲取的重要抗性基因資源既可以直接用于提高紫花苜蓿的抗逆性，也可以通過同源克隆的方法從紫花苜蓿中獲得同源基因[43]。研究證實，蒺藜苜蓿種質資源在抗鋁性上存在遺傳多樣性[44]。因此，在研究紫花苜蓿抗酸鋁機制中可以充分利用近親-蒺藜苜蓿模式植物的優(yōu)勢，從模式植物入手，可以克服紫花苜蓿基研究的一些缺點，這為全面研究并了解紫花苜蓿的耐鋁相關代謝途徑以及發(fā)掘耐鋁相關基因和其表達模式提供了新的途徑。

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