羅祺圓　許涵杰　郭鵬

摘 要：利用掃描電鏡技術(shù)，研究了紫花苜蓿在不同濃度（0，0.3%，0.9%，1.5%）NaCl溶液處理下氣孔的適應(yīng)性變化。通過對苜蓿葉片的氣孔長度、氣孔寬度、氣孔開度、氣孔密度及潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)等氣孔特征的觀察，探討氣孔特征與耐鹽性的關(guān)系。結(jié)果顯示：苜蓿葉片在鹽脅迫24 h后，除氣孔密度變化不明顯外，其他指標(biāo)均隨鹽濃度的增加而呈下降趨勢；鹽脅迫24 h后氣孔密度才開始增加，而其他指標(biāo)則隨鹽濃度的不同出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)現(xiàn)象。這說明在鹽脅迫下， 苜蓿葉片通過調(diào)節(jié)氣孔大小及開閉來減少水分蒸騰的同時，還通過增加氣孔數(shù)目來維持光合作用，增強其耐鹽性。

關(guān)鍵詞： 紫花苜蓿；氣孔；鹽脅迫

中圖分類號：S963.22+3.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.04.004

Abstract： The adaptive changes of stomata of alfalfa （Medicago sativa） under the stress of different NaCl concentration（0，0.3%，0.9% and1.5%） were studied by the technique of scanning electron microscope. The relationship between stomatal feature and salt tolerance were discussed by investigating these indices such as stomatal length， stomatal width， stomatal aperture， stomatal density， potential conductance index and so on. The main conclusions were that except for the change of stomatal density of alfalfa leaves were not very noticeable after the first day under salt stress， other indicators decreased with the increase of salt concentration and treat time. The increase in stomatal density did not begin until 24 hours later，while the other indicators recovered to different degrees under different NaCl stress. The research showed that leaves of alfalfa enhanced its salt tolerance by reducing transpiration through regulating the size and activity of stomata while improving photosynthesis through increasing the number of stomata.

Key words： alfalfa （Medicago sativa）； stomata； salt stress

土壤鹽漬化已成為一個全球性的問題，據(jù)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，世界各地的鹽漬地已超過8.0 × 109 hm2[1]。世界范圍內(nèi)至少20%的耕地正遭受著不同程度的鹽漬化危害，我國鹽堿化土地面積也近1億hm2[2]。隨著全球環(huán)境污染加劇，人口數(shù)量增多，水資源日趨匱乏，越來越多的回收水和其他二級水源被用于灌溉，這將會使更多的土地資源受到鹽害的威脅[3]。土壤鹽分對植物的傷害主要是過多的鹽離子打破了植物自身的離子和滲透平衡，造成離子毒害，影響植物的正常生存、生長和繁殖[4]。此外，植物體內(nèi)產(chǎn)生和積累的活性氧（ROS）引起的氧化脅迫等帶來的次生脅迫，同樣對植物造成傷害[5]。因鹽堿地改造成本高，見效慢，培育耐鹽堿環(huán)境的作物新品種是鹽堿地利用的一個有效思路。

苜蓿（Medicago sativa） 在我國的栽培歷史已有2 000多年之久，在豆科牧草中的抗鹽性較強，而且生長快，產(chǎn)量高，利用期長，營養(yǎng)豐富，適口性好，還能夠培肥地力[6-7]。開展苜蓿等植物的耐鹽機理研究對于有針對性的耐鹽育種具有重要意義。植物在鹽漬環(huán)境下，葉片的組織結(jié)構(gòu)對其反應(yīng)最為敏感[8]。鹽分由根系吸收，經(jīng)導(dǎo)管運輸?shù)降厣喜糠?。耐鹽植物主要通過氣孔的開閉來調(diào)節(jié)水分的蒸騰率以減少Na+隨蒸騰流進入葉片組織[9]。近年來，在植物生理學(xué)、進化論和全球生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域?qū)饪椎难芯慷紭O其重視。Heherington和Woodward也指出，氣孔孔隙面積雖只占葉片表面積的5%左右，但它的水分散失量卻相當(dāng)于一個沒有角質(zhì)層相似結(jié)構(gòu)的70%之多[10]。本研究以紫花苜蓿為試驗材料，采用掃描電鏡技術(shù)，討論了短期鹽脅迫對紫花苜蓿氣孔的形態(tài)結(jié)構(gòu)、氣孔密度及氣孔大小的影響，旨在探討葉片氣孔特征與耐鹽性的關(guān)系，為提高植物抗鹽性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

供試苜蓿為公農(nóng)一號紫花苜蓿種子（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草地研究所提供）。

1.2 研究方法

采用盆栽法，選取公農(nóng)一號紫花苜蓿種子，用0.5%次氯酸鈉消毒20 min，沖洗干凈后，將其均勻播種于放好基質(zhì)的小花盆里（播種基質(zhì)為輕質(zhì)的蛭石），之后用Hoagland培養(yǎng)液澆透。于室內(nèi)（25±1） ℃培養(yǎng)30 d后，用營養(yǎng)液配制的0%，0.3%，0.9%，1.5%NaCl鹽溶液分別進行處理。在處理后的0，1，2，3，24 h取新鮮葉片，用磷酸緩沖液（pH=7.2）洗凈葉表皮后，將葉片切成合適大小，在2.5%戊二醛中固定3～4 h，再用磷酸緩沖液清洗3～4次洗去多余的戊二醛，而后經(jīng)30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%（兩次）梯度乙醇逐級脫水，每次脫水時間15 min，最后用無水乙醇與醋酸異戊酯比例為2∶1，1∶1的溶液和純醋酸異戊酯置換乙醇，各15 min。干燥及金屬導(dǎo)電處理后使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察并照相。

1.3 測定指標(biāo)

（1） 氣孔長度、寬度的測定：氣孔長度是啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞長度；氣孔寬度是垂直于啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞的最寬值。

（2） 氣孔開度測定：氣孔的孔徑寬度。

（3） 氣孔密度：按每平方毫米的氣孔數(shù)計算氣孔密度。

（4） 潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)（Potential conductance index， PCI）：氣孔長度的平方與氣孔密度乘積[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件處理后，采用SPSS 13.0數(shù)據(jù)處理軟件進行相關(guān)性分析與顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)0.3%，0.9%，1.5%NaCl脅迫處理后，以掃描電鏡觀測苜蓿葉片氣孔的變化情況，對照及0.3%NaCl處理1，2，3，24 h后氣孔的形態(tài)如圖1（0～4）所示，0.9%NaCl處理1，2，3，24 h后氣孔的形態(tài)如圖1（5～8）所示，1.5%NaCl處理1，2，3，24 h后氣孔的形態(tài)如圖1（9～12）所示。

2.1 鹽脅迫下氣孔長度、寬度的變化

不同濃度鹽處理對苜蓿葉片的氣孔長度和寬度影響如表1和表2所示：氣孔長度和寬度隨著鹽脅迫程度的增加呈下降趨勢，且對氣孔寬度的影響更為明顯。與對照相比，1.5%NaCl處理24 h后，氣孔長度和寬度的下降幅度分別為25.19%和48.04%。鹽處理24 h后氣孔長度與寬度有所恢復(fù)，0.3%，0.9%，1.5%鹽濃度的氣孔長度分別恢復(fù)為原來的96.18%，89.31%，74.81%，而氣孔寬度也分別恢復(fù)為原來的81.37%，66.67%，51.96%。

2.2 鹽脅迫下氣孔開度的變化

不同濃度鹽處理對苜蓿葉片的氣孔開度的影響如表3所示。由表3可知，鹽脅迫可誘導(dǎo)苜蓿氣孔開度快速減小，以避免水分的蒸騰，減少由鹽分帶來的水分脅迫并有效防止高滲溶液的進入。鹽處理1 h 后即可觀察到不同NaCl濃度均可使氣孔有不同程度的關(guān)閉，處理3 h后，0.3%， 0.9%，1.5%NaCl可使氣孔開度分別縮小至對照的79.31%，51.72%，31.03%，與對照有顯著性差異。在處理24 h后，0.3%和0.9%NaCl可使氣孔開度恢復(fù)為對照的82.14%，53.57%。而1.5%NaCl處理后，氣孔開度恢復(fù)很慢，到24 h時，僅為對照的32.14%。這說明苜蓿在一定程度鹽脅迫下可快速產(chǎn)生自身調(diào)節(jié)機制，作出適應(yīng)性變化，顯示出較好的抗鹽性。

2.3 鹽脅迫下氣孔密度與潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)的變化

不同濃度鹽處理對苜蓿葉片的氣孔密度及潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)的影響如表4和表5所示。鹽處理后葉片的氣孔密度在3 h內(nèi)幾乎沒有變化，24 h后可以看出略有上升趨勢，1.5%NaCl處理氣孔密度達(dá)到最大，為217個·mm-2，與對照有顯著差異，是未經(jīng)處理的1.26倍。苜蓿這種氣孔密度變化的規(guī)律性可能是為了保證一定的光合氣孔面積，即在調(diào)節(jié)水分平衡的同時也維持光合作用的平衡。潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)的變化規(guī)律與氣孔開度的變化相一致，即在前期持續(xù)下降后于24 h開始隨不同鹽濃度出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。

氣孔特征與鹽濃度及處理時間的相關(guān)性分析結(jié)果如表6所示。相關(guān)分析顯示，鹽濃度與氣孔密度未達(dá)到顯著相關(guān)，但與氣孔長度、氣孔寬度、氣孔開度及潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，即隨著NaCl濃度的增加，上述指標(biāo)逐漸減??；而脅迫時間與氣孔長度、氣孔寬度、氣孔開度及潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)均未達(dá)到顯著相關(guān)，但與氣孔密度呈顯著正相關(guān)：這說明氣孔長度、氣孔寬度、氣孔開度及潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)在鹽處理后可快速做出適應(yīng)性反應(yīng)，只是隨鹽濃度的不同出現(xiàn)幅度的變化，而氣孔密度對鹽的響應(yīng)稍慢于上述指標(biāo)，隨處理時間的延長變化趨勢逐漸明顯。

3 結(jié)論與討論

植物生長在復(fù)雜的自然界環(huán)境中，既接受周圍環(huán)境提供的生長所需條件，同時也承受著不良因素的影響。鹽分對植物生長發(fā)育有一定的抑制作用，但有些植物在鹽生環(huán)境中仍能生長，這說明植物為了適應(yīng)不良環(huán)境，會在生理及結(jié)構(gòu)上做出適應(yīng)性調(diào)整。研究表明：葉片在外界環(huán)境的影響下變異性和可塑性最大，即葉對生態(tài)條件的反映最為明顯[12]。在鹽脅迫后的葉片中，有3個指標(biāo)是公認(rèn)的衡量植物耐鹽性強弱的重要生理指標(biāo)：清除植物體內(nèi)活性氧，維持體內(nèi)代謝平衡的抗氧化酶活性，膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量以及有機滲透調(diào)節(jié)劑脯氨酸的積累 [13-15]。近年來影響到這些生理功能變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)逐漸成為植物抗逆研究中較為活躍的領(lǐng)域。氣孔通過保衛(wèi)細(xì)胞的運動控制著CO2的吸收以及水蒸氣的散失，即影響著植物生長極其重要的光合和蒸騰作用兩大重要過程[16]。Downton等[17-18]在對菠菜和葡萄的研究中發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，植物的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均下降，以減少Na+向葉片的運輸，增強自身的抗鹽能力。此外，植物氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞還可以通過Na+、K+的選擇來維持離子平衡[19]。

為了分析鹽脅迫與氣孔開度的關(guān)系，本研究利用掃描電鏡觀察了鹽脅迫下植物的葉片氣孔特征的適應(yīng)性變化規(guī)律，探討了葉片氣孔特征與耐鹽性的關(guān)系。從觀察結(jié)果看，鹽處理1 h后就可從掃描電鏡中觀察到在不同鹽濃度下氣孔的縮短與變窄的現(xiàn)象，且對寬度的抑制作用更為明顯。氣孔開度也開始下降，這說明苜蓿葉片已經(jīng)快速地接受到外界鹽分濃度變化的信號，對自身結(jié)構(gòu)做出調(diào)整以進行防御性保護，且氣孔開度的下降隨鹽濃度的增加更加明顯（r =-0.582**）。但氣孔開度的下降在減少水分蒸發(fā)、維持水分平衡的同時也降低了光合作用，所以筆者在處理24 h后發(fā)現(xiàn)不同濃度處理組都開始出現(xiàn)了不同程度的恢復(fù)現(xiàn)象，0.3%鹽處理恢復(fù)到對照的82.14%，可能是對鹽分有了一定的適應(yīng)性。1.5%鹽處理也恢復(fù)到對照的32.14%，但開始出現(xiàn)畸形氣孔。此外，氣孔密度也于處理24 h后出現(xiàn)明顯增加，這就在保證不損失過多水分的同時也增加了光合作用的氣孔面積。

本研究僅從苜蓿耐鹽性和其葉片氣孔結(jié)構(gòu)特征之間的相關(guān)性入手做了一些初步的分析，希望能在此基礎(chǔ)之上利用相關(guān)技術(shù)對其耐鹽機理進行更深入的研究，從而為植物的抗鹽選育提供新的理論依據(jù)。

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