王秋蘭，高曉民，張 煦

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2. 蘭州大學(xué)病理研究所，甘肅 蘭州 730000)

白花蛇舌草總黃酮對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王秋蘭1，高曉民2，張 煦2

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2. 蘭州大學(xué)病理研究所，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討白花蛇舌草總黃酮對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 采用MTT法檢測(cè)3.125，6.25，9.375，12.5，25.0及50.0 μg/mL白花蛇舌草總黃酮作用24 h及48 h對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞的抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)白花蛇舌草總黃酮對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 作用24 h，白花蛇舌草總黃酮3.125,6.25 μg/mL對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，9.375，12.5，25，50 μg/mL有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高為51.5%,同期1μg/mL順鉑組為82.4%；作用48 h，白花蛇舌草總黃酮3.125,50 μg/mL對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，6.25,9.375,12.5,25 μg/mL對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞均有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高為67.3%,同期1μg/mL順鉑組為85.4%。實(shí)驗(yàn)各組48 h抑制率均高于24 h。經(jīng)白花蛇舌草總黃酮梯度藥物處理的BGC-823胃癌細(xì)胞懸浮死亡，且隨藥物濃度的增加懸浮死亡的細(xì)胞增多，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡特征。白花蛇舌草總黃酮試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，G1期細(xì)胞增加,S期細(xì)胞明顯減少，凋亡細(xì)胞比例明顯增高。結(jié)論 白花蛇舌草總黃酮對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有明顯抑制作用，并表現(xiàn)出一定范圍內(nèi)的時(shí)-效及量-效關(guān)系，作用機(jī)制可能與抑制DNA的合成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

白花蛇舌草；總黃酮；BGC-823胃癌細(xì)胞；增殖；凋亡

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWild)系茜草科耳草屬植物, 為帶根全草，別名蛇舌草，具有清熱解毒、利濕、消腫鎮(zhèn)痛、抗癌，增強(qiáng)免疫之功效[1]。白花蛇舌草總黃酮是從白花蛇舌草中提取的有效成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤的作用[2-4]。目前該成分的提取工藝已取得較大發(fā)展，相關(guān)研究眾多[5-6]，而其臨床應(yīng)用有待拓展。筆者觀察了白花蛇舌草總黃酮體外對(duì)人BGC-823胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料 白花蛇舌草購(gòu)于蘭州安寧醫(yī)藥公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室林麗老師鑒定為茜草科耳草屬白花蛇舌草干燥全草。乙醇回流法提取白花蛇舌草總黃酮，AB-8型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂(滄州寶思吸附材料科技有限公司)進(jìn)行純化，總黃酮純度約為23.82%，用DMEM配置成100 μg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，分裝，4 ℃保存。蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：201207)，順鉑(齊魯制藥有限公司)，BCG-823胃癌細(xì)胞株(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)李海龍老師惠贈(zèng))，MTT、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma 公司),DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國(guó)HyClone公司)。Annexin V-FITC /PI凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司)，碘化丙啶(Sigma公司)。酶標(biāo)儀(ELX-800，美國(guó)BIO-TEK公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó) Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖的檢測(cè) MTT法檢測(cè)BGC-823胃癌細(xì)胞增殖情況。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823胃癌細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按1.0×107L-1細(xì)胞濃度100 μL加入96孔平底板，5%CO2，37 ℃下孵育，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁后，加入白花蛇舌草總黃酮梯度藥物，使其中濃度分別為3.125,6.25,12.5,25.0,50.0 μg/mL，每孔100 μL,設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置培養(yǎng)基、藥物調(diào)零孔、同體積PBS對(duì)照孔及1 μg/mL順鉑對(duì)照孔。24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)量各孔的吸光值。按下列公式計(jì)算增殖抑制率:增殖抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100 %。根據(jù)抑制率篩選藥物濃度。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823胃癌細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2.0×108L-1接種于培養(yǎng)瓶中，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞貼璧培養(yǎng)24 h后加入梯度白花蛇舌草總黃酮，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察BGC-823胃癌細(xì)胞形態(tài)并攝片。

1.2.3 細(xì)胞周期的檢測(cè) 將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度為70%的BGC-823胃癌細(xì)胞分為3組，加入PBS為陰性對(duì)照組，1 μg/mL順鉑為陽(yáng)性對(duì)照組，用最佳抑菌濃度白花蛇舌草總黃酮作用為實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞數(shù)約1.0×106個(gè)，24 h后PBS洗滌，4 ℃條件下70%乙醇固定，過(guò)夜，PI染色，400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

1.2.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分2組，PBS為對(duì)照組，用9.375 μg/mL白花蛇舌草總黃酮作用24 h為實(shí)驗(yàn)組。采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1各組BGC-823胃癌細(xì)胞增殖情況 作用24 h，3.125，6.25 μg/mL白花蛇舌草總黃酮對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，9.375，12.5，25，50 μg/mL對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高；順鉑組抑制率更高。作用48 h， 3.125，50 μg/mL白花蛇舌草總黃酮對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞抑制率較低，6.25,9.375,12.5,25 μg/mL對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞均有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高；順鉑組抑制率更高。實(shí)驗(yàn)各組48 h抑制率均高于24 h；12.5 μg/mL與9.375 μg/mL抑制率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。9.375 μg/mL為最佳抑菌濃度。見(jiàn)表1。

表1 各組BGC-823胃癌細(xì)胞增殖情況

注：①與對(duì)照組比較。

2.2 各組BGC-823胃癌細(xì)胞形態(tài)比較 光學(xué)顯微鏡下觀察，未經(jīng)白花蛇舌草總黃酮處理的BGC-823胃癌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，多邊形且排列密集，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，細(xì)胞邊緣清晰，見(jiàn)圖1。經(jīng)白花蛇舌草總黃酮梯度藥物處理的BGC-823胃癌細(xì)胞懸浮死亡，且隨藥物濃度的增加，懸浮死亡的細(xì)胞亦增多；細(xì)胞膜皺縮，排列稀疏，體積變小，細(xì)胞變形呈圓形或橢圓形，部分細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡特征，見(jiàn)圖2。

2.3 各組BGC-823胃癌細(xì)胞周期比較 與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞比例增加,S期細(xì)胞明顯減少；與順鉑組比較，實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞比例相似，G2期細(xì)胞明顯減少。見(jiàn)圖3～5。

圖1 對(duì)照組BGC-823胃癌細(xì)胞形態(tài)

圖2 實(shí)驗(yàn)組9.375 μg/mL白花蛇舌草總黃酮干預(yù)48 h BGC-823胃癌細(xì)胞形態(tài)

圖3 陰性對(duì)照組細(xì)胞周期

2.4 各組BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡情況 實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，活細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組。見(jiàn)圖6及圖7。

3 討 論

白花蛇舌草總黃酮抗腫瘤作用明顯。王宇翔等[10]研究認(rèn)為,白花蛇舌草總黃酮可明顯促進(jìn)Cy降低小鼠LpS和ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng),提高T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力,該總黃酮60 mg/kg可明顯促進(jìn)Cy降低小鼠脾臟IgM抗體形成,有增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫作用,且對(duì)腫瘤化療藥物有一定的解毒作用。周憶新等[3]研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草總黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG-2形態(tài)有明顯影響,并可抑制其生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。吳楊等[11]用乙醇回流法提取白花蛇舌草總黃酮并發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2有明顯抑制作用，并且隨著濃度的增大,抑制率越高；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),抑制率也增高。楊嫻等[12]報(bào)道白花蛇舌草總黃酮能有效抑制黑色素瘤A375和B16細(xì)胞增殖,且具有一定的時(shí)-效和量-效關(guān)系。楊培民等[13]研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草脂質(zhì)體中的多糖和黃酮成分配伍應(yīng)用,共奏“扶正祛邪”之效,符合傳統(tǒng)中醫(yī)復(fù)方“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的作用特點(diǎn),從而發(fā)揮“整體效應(yīng)”。張碩等[14]利用基因芯片技術(shù)研究了白花蛇舌草總黃酮抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的靶基因及其調(diào)控，結(jié)果篩選出20個(gè)總黃酮抑制肝癌細(xì)胞的有效基因，其中癌基因pim-1、rel、ras、fos、myc、met及Bcl-2顯著下調(diào),抑癌基因NF2顯著上調(diào),成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、G蛋白耦聯(lián)受體、酪氨酸蛋白磷酸化酶、轉(zhuǎn)錄因子12等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子顯著下調(diào)，而絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路成員MAP2K6和MAP3K12、T細(xì)胞活化共刺激信號(hào)分子TNFSF9、TNFSF7基因顯著上調(diào)。研究表明總黃酮抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721由多個(gè)基因協(xié)調(diào)，并通過(guò)胞內(nèi)、胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑共同完成。進(jìn)一步研究表明，白花蛇舌草總黃酮在體內(nèi)、體外具有抑制肝癌細(xì)胞的作用，這種作用與阻滯腫瘤細(xì)胞增殖周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、血清TNF-α水平，改善機(jī)體免疫環(huán)境等有關(guān)[15]。顧玉蘭等[16]研究結(jié)果顯示白花蛇舌草乙醇提取物能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞BGC-823端粒酶的活性，并呈劑量依賴性[17]。

圖4 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期

圖5 陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞周期

圖6 對(duì)照組BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡情況

圖7 實(shí)驗(yàn)組BGC-823胃癌細(xì)胞凋亡情況

本研究結(jié)果顯示，9.375，12.5，25，50 μg/mL白花蛇舌草總黃酮作用24 h對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞均有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高；6.25，9.375，12.5，25 μg/mL白花蛇舌草總黃酮作用48 h對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞均有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高。實(shí)驗(yàn)各組48 h抑制率均高于24 h。12.5 μg/mL與9.375 μg/mL抑制率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇藥物濃度9.375 μg/mL用于細(xì)胞周期和凋亡的檢測(cè)。白花蛇舌草總黃酮對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞抑制作用表現(xiàn)出一定范圍內(nèi)的時(shí)間-效應(yīng)及劑量-效應(yīng)關(guān)系，其機(jī)制有可能是多個(gè)基因協(xié)調(diào),包括癌基因如ras、fos、myc、met 及Bcl-2抑制,抑癌基因如NF2的激活,并通過(guò)胞內(nèi)、胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑共同完成，如MAPK及TPK等。

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)白花蛇舌草總黃酮梯度藥物處理的BGC-823細(xì)胞懸浮死亡，且隨藥物濃度的增加，懸浮死亡的細(xì)胞亦增多；細(xì)胞變形，部分細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡特征；凋亡細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，活細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組，這種作用與阻滯腫瘤細(xì)胞增殖周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。另外白花蛇舌草總黃酮組G1期細(xì)胞增加,S期細(xì)胞明顯減少，提示白花蛇舌草總黃酮對(duì)DNA復(fù)制有一定的抑制作用，可能通過(guò)抑制端粒酶的活性起作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典[M]. 上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1997:674-745

[2] 王宇翎,張艷,方明,等. 白花蛇舌草總黃酮的抗炎及抗菌作用明[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2005,21(3):348-350

[3] 周憶新,吳楊,顧珉. 白花蛇舌草總黃酮體外對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2的作用[J]. 抗感染藥學(xué),2009,6(3):38-40

[4] 吳楊,周憶新,吳銀生. 白花蛇舌草總黃酮的提取以及體外對(duì)肝癌細(xì)胞的作用[J]. 抗感染藥學(xué),2008,5(3):150-152

[5] 毛杏飛，羅佳波. 白花蛇舌草中總黃酮提取分離工藝的研究[J]. 中藥材,2002,25(7):499-500

[6] 張彩霞，蔡定建，方文英. 白花蛇舌草中黃酮提取工藝的優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011,39(1):131-133；136

[7] 劉延吉,孫素梅,王學(xué)密,等. AB-8型大孔樹(shù)脂分離純化南果梨黃酮類化合物的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2008(2):68-70

[8] 高紅寧,金萬(wàn)勤,郭立偉,等. AB-8 型樹(shù)脂對(duì)苦參總黃酮的吸附性能研究[J]. 中草藥, 2001,32(10):887-889

[9] 楊培民,代龍,魏永利. 大孔吸附樹(shù)脂分離純化白花蛇舌草總黃酮的研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,33(6):417-424

[10] 王宇翔,張艷,方明,等. 白花蛇舌草總黃酮的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2005,21(4):444-447

[11] 吳楊,周憶新,吳銀生. 白花蛇舌草總黃酮的提取以及體外對(duì)肝癌細(xì)胞的作用[J]. 抗感染藥學(xué),2008,5(3):150-152

[12] 楊嫻,劉汝青,杜德榮,等. 白花蛇舌草總黃酮對(duì)黑色素瘤A375和B16細(xì)胞增殖抑制作用的研究[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,6(10)：844-847

[13] 楊培民. 白花蛇舌草抗腫瘤有效部位黃酮和多糖的純化及其脂質(zhì)體復(fù)合物的研究[D]. 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2011

[14] 張碩,宋衍芹,周三,等. 白花蛇舌草總黃酮抑制人肝癌細(xì)胞的靶基因調(diào)控[J]. 世界華人消化雜志,2007,15(10):1060-1065

[15] 張碩,宋衍芹,周三,等. 白花蛇舌草總黃酮對(duì)肝癌的體內(nèi)外抑制作用及對(duì)小鼠移植性肝癌H22細(xì)胞增殖周期、凋亡、免疫環(huán)境的影響[J]. 世界華人消化雜志,2007,15(12):1347-1352

[16] 顧玉蘭,朱海杭,卜平. 幾種中藥抗胃癌多藥耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理,2007,18(2):114-116

[17] 王贊滔,黃艷麗,王文靜. 白花蛇舌草作用于人胃癌細(xì)胞BGC-823后端粒酶的定量表達(dá)[J]. 臨床輸血與檢驗(yàn),2006,8(2):116-117

Effect of the total flavones of oldenlandia diffusa on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cell BGC-823

WANG Qiulan1, GAO Xiaomin2, ZHANG Xu2

(1.Clinical Medical College of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu, China; 2. Pathology Institute of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu, China)

Objective It is to approach the influence of the total flavones of oldenlandia diffusa (TFOD) on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cell BGC-823. Methods The inhibition of TFOD in dose of 3.125, 6.25, 9.375, 12.5, 25.0 and 50.0 μg/mL on BGC-823 cells for 24 and 48 hours were measured by MTT assay; the influence of TFOD on the proliferation cycle and apoptosis of BGC-823 was detected by Flow Cytometry. Results After 24 hours, the dose of TFOD in 3.125 and 6.25 μg/mL had no obvious inhibition, but in 9.375, 12.5, 25.0 and 50.0 μg/mL had obvious inhibitory effect, the highest inhibition rate was 51.5% that appeared in 12.5 μg/mL group, positive control group 1μg/mL cisplatin was 82.4%; after 48 hours, the dose of TFOD in 3.125 and 50.0 μg/mL had no obvious inhibition, but in 9.375, 12.5 and 25.0 μg/mL had obvious inhibitory effect, the highest inhibition rate was 67.3% that appeared in 12.5 μg/mL group, too, positive control group 1 μg/mL cisplatin was 85.4%; inhibition rate of 48 hours were higher than that of 24 hours in experimental group; BGC- 823 cells treated by TFOD in gradient, cell died, and with the increase of drug concentration, the increase in the number of cells death; cell membrane shrinked, arranged sparsely, volume contracted, cell deformed into circular or elliptic, presented apoptosis features; compared to control group, cells in G1phase of TFOD increased, and cells in S phase decreased significantly; the apoptosis cell ratio is significantly higher than that of the control group. Conclusion TFOD has inhibitory effect on gastric cancer cells BGC- 823 in vitro and shows time-effect and dose-effect relationship in a certain range; the mechanism may be related to inhibition of TFOD in DNA synthesis and inducing cell apoptosis.

oldenlandia diffusa; total flavones; gastric cancer cells BGC-823; proliferation; apoptosis

王秋蘭，女，碩士，副教授,主治醫(yī)師，從事腫瘤學(xué)研究。

甘肅省高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2012-5)；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(145RJZA235)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.004

R-33

A

1008-8849(2015)21-2289-04

2015-03-15