李軍，董曉，王俊峰，周明，雷楓琴，龍海燕，明登峰，黨書毅

? 論著 ?

臍血干細(xì)胞移植對(duì)缺血性心肌病患者體內(nèi)炎癥因子的影響

李軍，董曉，王俊峰，周明，雷楓琴，龍海燕，明登峰，黨書毅

目的初步探討人臍血干細(xì)胞（HUCBSC）對(duì)缺血性心肌?。↖CM）患者體內(nèi)炎癥因子的影響。方法選擇自2010年4月至2013年12月期間于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院心內(nèi)科確診缺血性心肌病的患者29例，其中男性17例，女性12例。冠狀動(dòng)脈移植組7例，外周靜脈移植組8例，對(duì)照組14例。對(duì)照組：規(guī)范的藥物治療；外周靜脈移植組：規(guī)范的藥物治療+經(jīng)外周靜脈移植HUCBSC；冠狀動(dòng)脈移植組：規(guī)范的藥物治療+經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植HUCBSC。分別記錄3組在0月（治療后當(dāng)天）、1月、3月、6月檢測(cè)的C反應(yīng)蛋白（CRP）、白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、B型腦鈉肽（BNP）的變化。結(jié)果與對(duì)照組比較，外周靜脈移植組和冠狀動(dòng)脈移植組治療后第1月、第3個(gè)月和第6個(gè)月BNP下降更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。三個(gè)組在0月、1月、3月、6月等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，血漿IL-6水平、C反應(yīng)蛋白、TNF-α均呈逐漸下降的趨勢(shì)，但3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。結(jié)論經(jīng)外周靜脈和冠狀動(dòng)脈途徑移植HUCBSC治療ICM未誘發(fā)炎癥反應(yīng)，是一種安全有效的治療方法。

缺血性心肌??；臍血干細(xì)胞；細(xì)胞移植；炎癥反應(yīng)

缺血性心肌?。╥schemic cardiomyopathy，ICM）是由于冠狀動(dòng)脈狹窄閉塞、慢性心肌缺血、壞死，導(dǎo)致心臟擴(kuò)大、彌漫性纖維化、心律失常，致使嚴(yán)重心肌功能障礙，其屬于終末期冠心病。近年來，許多學(xué)者使用人的臍血干細(xì)胞（human umbilical cord bloodstem cells，HUCBSC）進(jìn)行心肌移植的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示移植的干細(xì)胞不僅起到心肌再生、穩(wěn)定心肌組織結(jié)構(gòu)的作用，還可通過分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)梗死心肌的血管再生，改善心功能，減輕氧自由基對(duì)心肌的損傷，縮小梗死面積[1]。本研究經(jīng)冠狀動(dòng)脈和經(jīng)外周靜脈移植HUCBSC來治療ICM患者，探討其對(duì)體內(nèi)炎癥因子的影響，初步評(píng)估臨床效果和安全性。

1資料和方法

1.1 研究對(duì)象和分組選擇自2010年4月至2013年12月期間于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院心內(nèi)科確診缺血性心肌病的患者29例，其中男17例，女12例。冠狀動(dòng)脈移植組7例，外周靜脈移植組8例，對(duì)照組14例。本研究方案經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有入組患者均簽署知情同意書。

1.2 缺血性心肌病診斷標(biāo)準(zhǔn)超聲心動(dòng)圖+臨床癥狀+冠狀動(dòng)脈造影確診：①超聲心動(dòng)圖：心臟擴(kuò)大、左室射血分?jǐn)?shù)降低（LVEF＜45%）、室壁局灶性及節(jié)段性運(yùn)動(dòng)異常；②紐約心功能分級(jí)：根據(jù)患者臨床癥狀判定紐約心功能3～4級(jí)；③冠狀動(dòng)脈造影：均證實(shí)為兩支或三支血管嚴(yán)重病變。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)有以下病史者予以排除：心臟瓣膜病，心房顫動(dòng)，惡性腫瘤，外周血管病，6個(gè)月內(nèi)嚴(yán)重外傷、嚴(yán)重感染、手術(shù)、使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑，慢性肝腎疾病，自身免疫病等。

1.4 方法所有患者均服用阿司匹林及他汀類藥物。根據(jù)患者個(gè)體差異、合并的疾病及并發(fā)癥等具體情況，參照心衰治療指南，規(guī)律服用ACEI/ ARB、β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑、利尿劑、洋地黃、曲美他嗪和硝酸酯類藥物。對(duì)照組：規(guī)范的藥物治療；外周靜脈移植組：規(guī)范的藥物治療+經(jīng)外周靜脈移植HUCBSC；冠狀動(dòng)脈移植組：規(guī)范的藥物治療+經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植HUCBSC。穿刺右側(cè)橈動(dòng)脈，植入橈動(dòng)脈鞘管，使用6F通用造影導(dǎo)管行冠狀動(dòng)脈造影，并經(jīng)造影導(dǎo)管注射HUCBSC懸液，經(jīng)左主干注射干細(xì)胞總量的2/3，經(jīng)右冠脈開口注射余下的1/3。所有患者均常規(guī)心電監(jiān)護(hù)24 h，嚴(yán)密觀察有無過敏、心律失常等不良反應(yīng)。所有患者均接受兩次干細(xì)胞治療，間隔時(shí)間為1月。

1.5 臍血干細(xì)胞所采用的HUCBSC由深圳市北科生物科技有限公司提供。所有HUCBSC培養(yǎng)過程中定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)控并且記錄，包括無菌、支原體和內(nèi)毒素（≤0.5 EU/ml）的檢測(cè)結(jié)果，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)時(shí)嚴(yán)格無菌操作，HUCBSC輸入量為100ml，細(xì)胞總量約為5×107個(gè)（包括0.2～1.0% CD34+細(xì)胞）并且存活率大于85%。

1.6 血液標(biāo)本采集及檢測(cè)所有入組患者均在干細(xì)胞治療后當(dāng)天、干細(xì)胞治療后1月、3月、6月時(shí)采集肘部靜脈血液15 ml，置于酶抑制劑抗凝管中，3000 r/min（約730g）低溫離心15 min，分離血漿置于-80℃冰箱保存。用以檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。白細(xì)胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定，試劑盒為生物工程上海股份有限公司提供。其余指標(biāo)在本院檢驗(yàn)科采用自動(dòng)生化分析儀（HIIACHI 7170A Automatic Analyzer）進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組間均數(shù)比較用單因素方差分析（組間兩兩比較用Q檢驗(yàn)）；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Prism 5.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組之間的基線資料比較三組患者在年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙飲酒史比例、合并高血壓比例、合并血脂血糖異常比例等方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。三組患者生化檢查結(jié)果白細(xì)胞、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶同工酶、心肌肌鈣蛋白T等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（表1）。

2.2 各組之間B型腦鈉肽（BNP）的變化與對(duì)照組比較，外周靜脈移植組和冠狀動(dòng)脈移植組治療后第1月、第3個(gè)月和第6個(gè)月BNP下降更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（圖1）。

2.3 各組間IL-6變化三個(gè)組在0月（治療后當(dāng)天）、1月、3月、6月等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，血漿IL-6水平均呈逐漸下降的趨勢(shì)，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（圖2）。

2.4各組間C反應(yīng)蛋白（CRP）變化三個(gè)組在0月、1月、3月、6月等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，CRP呈逐漸下降的趨勢(shì)，但對(duì)照組與外周靜脈移植組和冠狀動(dòng)脈移植組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（圖3）。

2.5 各組間TNF-α變化三個(gè)組在0月、1月、3月、6月等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TNF-α呈逐漸下降的趨勢(shì)，但對(duì)照組與外周靜脈移植組和冠狀動(dòng)脈移植組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（圖4）。

2.6 不良反應(yīng)情況所有患者在HUCBSC移植后6個(gè)月的隨訪中，均未出現(xiàn)心律失常。研究過程中未發(fā)生發(fā)熱、過敏反應(yīng)、栓塞事件等。

3討論

表1 各組一般資料比較

當(dāng)前我國ICM發(fā)病率急劇上升，ICM的治療日益受到關(guān)注。臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，藥物及介入治療并不能逆轉(zhuǎn)以心肌細(xì)胞損傷為基礎(chǔ)的ICM的發(fā)展。有部分ICM患者雖然經(jīng)過積極的血運(yùn)重建，但最終因存活的心肌細(xì)胞太少而死亡。而以細(xì)胞移植為主的干細(xì)胞治療方法變得備受矚目[2]。

圖1 不同干預(yù)方式在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)BNP的影響

圖2 不同干預(yù)方式在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)IL-6水平的影響

圖3 不同干預(yù)方式在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)CRP水平的影響

2001年Orllic[3]首次報(bào)告了干細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在提取綠色熒光蛋白表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞注射入梗死組織9 d后，新形成的心肌組織在心室的梗死區(qū)域占68%，提示成體的干細(xì)胞能產(chǎn)生新的心肌組織。Jochen等[4]對(duì)梗塞心肌細(xì)胞移植后6個(gè)月的移植細(xì)胞的存活率和功能進(jìn)行了研究，在所治療的小鼠中，心臟射血功能都得到改善，梗塞區(qū)收縮期反向膨脹減少，動(dòng)力障礙也明顯減少，受試對(duì)象獲得了長(zhǎng)期生存，且心功能得到了長(zhǎng)期改善。Mohit等[5]利用MI小鼠模型研究成肌細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)也得到了相同的結(jié)論。2003年Britten等[6]報(bào)告了TOPCARE-AM I研究，入選28例急性心肌梗死患者，使在冠脈重建后植入骨髓或血液造血干細(xì)胞，LVEF從（44± 10）%增加到術(shù)后4個(gè)月時(shí)的（49±10）%，壞死組織容積由（46±32）ml減少到（37±28）ml。

目前干細(xì)胞的獲得途徑主要有胚胎、骨髓和臍血。臍帶血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液。臍帶血具有干細(xì)胞來源豐富、對(duì)供者無不良影響、HLA配型相合程度要求低、傳染病毒風(fēng)險(xiǎn)低、移植后嚴(yán)重排斥發(fā)生率較低以及實(shí)物儲(chǔ)存能夠隨時(shí)獲得等優(yōu)點(diǎn)。臍帶血造血干細(xì)胞移植是利用臍帶血中的干細(xì)胞重建造血免疫的一種造血干細(xì)胞移植療法。部分學(xué)者用HUCBSC進(jìn)行了心肌移植實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示移植的干細(xì)胞不僅起到心肌再生、穩(wěn)定心肌組織結(jié)構(gòu)的作用，還可通過分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)梗死心肌的血管再生，改善心功能，減輕氧自由基對(duì)心肌的損傷，縮小心肌梗死面積[7,8]。其機(jī)制可能與人臍血干細(xì)胞再生心肌細(xì)胞，促進(jìn)新生血管形成，限制梗死心肌中細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，通過旁分泌機(jī)制改善心室重塑及減輕氧自由基對(duì)心肌的損傷等相關(guān)[9-15]。

BNP是心室分泌的一種血管活性肽，目前是臨床上評(píng)價(jià)心功能變化的一個(gè)重要指標(biāo)[16-19]。本研究中，在ICM患者中采用經(jīng)外周靜脈移植和經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植兩種方式移植HUCBSC，結(jié)果顯示從移植術(shù)后第1個(gè)月開始，細(xì)胞移植的兩組與對(duì)照組相比，BNP開始下降，在第3個(gè)月和第6個(gè)月兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，BNP下降更為明顯。此外，結(jié)果還顯示，對(duì)照組雖然僅采用藥物治療，但BNP水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，也呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，提示規(guī)范的服用抗心衰藥物是ICM治療的基礎(chǔ)。

在心衰的進(jìn)展中，炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用，炎癥因子是評(píng)估炎癥反應(yīng)和心衰程度的重要指標(biāo)，其水平越高，提示體內(nèi)炎癥反應(yīng)和心衰的程度越重[20]。IL-6與TNF-α是體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫功能和代謝過程的炎性細(xì)胞因子,它們通過介導(dǎo)心室重構(gòu)、降低心肌收縮力、使β1腎上腺受體失偶聯(lián)等作用促進(jìn)心衰的發(fā)生、發(fā)展。CRP是體內(nèi)反應(yīng)炎癥程度的標(biāo)志物。在本研究，結(jié)果顯示IL-6、TNF-α和CRP隨著治療的進(jìn)展，其水平逐漸下降。提示HUCBSC移植治療ICM未誘發(fā)和激活體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，且能協(xié)同藥物降低炎癥因子，抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)，是一種安全的治療方式。

HUCBSC移植在治療ICM方面已表現(xiàn)出傳統(tǒng)治療方法無法比擬的優(yōu)勢(shì)，但因其尚處于探索性研究階段，仍有許多問題有待解決，諸如HUCBSC的體外分離、培養(yǎng)，最適宜的移植治療時(shí)間，最有利的移植途徑，最佳的移植數(shù)量，分化程度如何以及其療效和安全性等。本研究中，無栓塞、心律失常等負(fù)性臨床事件發(fā)生，同時(shí)結(jié)果還提示HUCBSC移植未誘發(fā)炎癥反應(yīng)。然而，由于發(fā)病率、區(qū)域、觀念、經(jīng)費(fèi)等客觀因素影響，本項(xiàng)目中納入研究的病例有限，樣本量較小，因而其意義僅為初步探討，HUCBSC移植確切療效以及安全性的進(jìn)一步評(píng)價(jià)等，有待于多家有條件的醫(yī)院合作，進(jìn)行大樣本、隨機(jī)、雙盲的RCT研究。

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Influence of transplantation of human umbilical cord blood stem cells on inflammatory factors in patients with ischemic cardiomyopathy

LI Jun*, DONG Xiao, WANG Jun-feng, ZHOU Ming, LEI Feng-qin, LONG Haiyan, MING Deng-feng, DANG Shu-yi.*Department of Cardiology, Taihe Hospital of Hubei Medical College, Shiyan City, Hubei Province, Shiyan 442000, China.

DANG Shu-yi, E-mail: hbysthdsy@sina.com

ObjectiveTo investigate initially the influence of transplantation of human umbilical cord blood stem cells (HUCBSC) on inflammatory factors in patients with ischemic cardiomyopathy (ICM).MethodsICM patients (n=29, male 17 and female 12) were chosen from Apr. 2010 to Dec. 2013, and divided into intracoronary transplantation group (n=7), peripheral venous transplantation group (n=8) and control group (n=14). The control group was treated with normative drugs, peripheral venous transplantation group, with normative drugs+peripheral venous transplantation of HUCBSC and intracoronary transplantation group, with normative drugs+intracoronary transplantation of HUCBSC. The changes of C-reactive protein (CRP), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and B-type natriuretic peptide (BNP) were recorded respectively in 3 groups after 0 m (the same day of treatment time), 1 m, 3 m and 6 m.ResultsCompared with control group, BNP decreased significantly in other 2 groups after 1 m, 3 m and 6 m (all P＜0.05). The levels of IL-6, CRP and TNF-α had a descending trend after 0 m, 1 m, 3 m and 6 m in 3 groups but the difference had no statistical significance among 3 groups (all P＞0.05).ConclusionVenous transplantation of HUCBSC and intracoronary transplantation of HUCBSC have not induce inflammation reaction in treatment of ICM, which are safe and effective therapies.

Ischemic cardiomyopathy; Umbilical cord blood stem cells; Cell transplantation; Inflammation reaction

R542.2

A

1674-4055(2015)04-0454-04

2015-04-06）

（責(zé)任編輯：姚雪莉）

湖北省科技廳研項(xiàng)目(2011CDC049);十堰市科技局重點(diǎn)研究項(xiàng)目(072S);十堰市太和醫(yī)院國家自然科學(xué)基金培育項(xiàng)目(2014PY03)

442000 十堰,湖北省十堰市湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院心內(nèi)科(李軍,董曉,王俊峰,周明,雷楓琴,龍海燕,黨書毅);干細(xì)胞治療中心(明登峰)

黨書毅,E-mail:hbysthdsy@sina.com

10.3969/j.1674-4055.2015.04.07