查小應，黃 磊,楊木清,歐敬民,陳大偉,費哲為

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院，上海 200092；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150)

葉酸缺乏協(xié)同保羅樣激酶1小干擾RNA抑制胃癌細胞株生長的研究

查小應1，黃 磊2,楊木清1,歐敬民1,陳大偉2,費哲為1

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院，上海 200092；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150)

目的 探討葉酸缺乏和保羅樣激酶1(PLK-1)小干擾RNA(siRNA)的聯(lián)合作用對胃癌腫瘤細胞的影響。方法 PLK-1 siRNA用LipofectamineTM 2000作載體轉(zhuǎn)染胃癌細胞株SGC7901和BGC823，real-time PCR和Western blot驗證轉(zhuǎn)染效果；然后將轉(zhuǎn)染的 SGC7901和BGC823細胞株，繼續(xù)在葉酸缺乏和正常葉酸濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，檢測細胞增殖、凋亡、周期和蛋白Bcl-2的變化情況。結(jié)果 葉酸缺乏與PLK-1 siRNA具有協(xié)同抑制SGC7901、BGC823細胞增殖，促進凋亡和使細胞周期停滯在G2/M期的作用，二者能協(xié)同抑制SGC7901、BGC823 Bcl-2蛋白表達。結(jié)論 葉酸缺乏和PLK-1 siRNA均能抑制胃癌細胞SGC7901、BGC823的生長，兩者具有協(xié)同效應。該效應可能與Bcl-2蛋白的抑制有關。

葉酸;胃癌細胞;保羅樣激酶1;小干擾RNA

胃癌發(fā)病率在國內(nèi)和國際上都排在惡性腫瘤的第二位，國際上每年大約有1 000 000個新發(fā)病例[1-2]。腫瘤的發(fā)生是多靶點、多環(huán)節(jié)調(diào)控失衡的結(jié)果，進一步探討腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制，針對不同腫瘤個體，采用個體差異、多靶點聯(lián)合治療是提高腫瘤治療療效的關鍵。保羅樣激酶(polo-like kinase, PLK)是一類高度保守的與果蠅保羅絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)和功能類似的蛋白[3]。已經(jīng)有研究證實，PLK-1在各種惡性腫瘤包括胃癌組織中存在著過表達且與腫瘤的預后密切相關[4]，抑制腫瘤的PLK-1可以有效抑制腫瘤細胞增殖并誘導凋亡，是近年來腫瘤基因治療的又一個新的候選靶點[5]。在抑制蛋白的表達方法中，小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)即原細胞內(nèi)的或外源性導入的雙鏈RNA(dsRNA)被切割成有效的RNA，其與RNA誘導沉默復合體結(jié)合，將與該RNA配對的mRNA相應序列切除而降低基因的表達[6]。已有研究表明，PLK-1 siRNA能抑制胃癌細胞生長[7]。臨床中許多胃癌患者，尤其是老年患者葉酸缺乏。既往研究多關注葉酸缺乏后如何導致腫瘤的再生等問題，對于已有葉酸缺乏的患者，葉酸水平的不同對于腫瘤患者預后以及對腫瘤治療的影響鮮有研究。本研究通過觀察胃癌細胞系經(jīng)PLK-1 siRNA干擾后在不同濃度葉酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)情況，探討葉酸缺乏對PLK-1 siRNA抑制腫瘤作用的影響，現(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1 實驗材料 胃癌細胞株SGC7901(由吳克瑾教授贈送)和BGC823(購自博古生物科技有限公司，上海)。葉酸缺乏的RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)等細胞培養(yǎng)相關產(chǎn)品，除特殊說明外，均購自Invitrogen公司。葉酸購自Sigma-Aldrich公司。PLK-1 siRNA由Genechem公司設計合成，其序列為：5’-CAACCAAAGTCGAATATGA-3’。 LipofectamineTM 2000 購自Invitrogen 公司。CCK-8購自同仁化學。Real-time PCR試劑盒購自Takara公司。Anexin V凋亡檢測試劑盒購自BD公司。兔抗人PLK-1、p53、Bcl-2、GAPDH一抗購自CST公司。RIPA裂解液等蛋白提取、濃度測定等產(chǎn)品購自碧云天生物研究所。其他藥品為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗分組 按事先轉(zhuǎn)染的成分不同以及后續(xù)培養(yǎng)基不同分為先行PLK-1 siRNA干擾然后在無葉酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h組(Null + PLKS組)、先行PLK-1 siRNA干擾然后在正常葉酸濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h組(Control + PLKS組)、無PLK-1 siRNA而用PBS作對照的轉(zhuǎn)染然后在無葉酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h組(Null + PBS組)、無PLK-1 siRNA而用PBS作對照的轉(zhuǎn)染然后在正常葉酸濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h組(Control + PBS組)。

1.3 實驗方法

1.3.1 PLK-1 siRNA LipofectamineTM 2000的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染過程嚴格按照說明書施行。其基本步驟為：轉(zhuǎn)染前24h，在每塊6孔板的每個孔內(nèi)用2 mL不含雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基接種對數(shù)生長期的腫瘤細胞5×105個。經(jīng)過24h，細胞融合度為40%。用250 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋siRNA (siRNA的量為100 pmol) ，混勻。用250 μL Opti-MEM稀釋5.0 μL LipofectamineTM 2000，混勻，室溫下靜置5 min。 將以上混合轉(zhuǎn)染試劑和siRNA稀釋液混勻，室溫下靜置20 min。轉(zhuǎn)染復合物加入到6孔細胞板中，前后輕搖細胞板混合均勻。轉(zhuǎn)染6 h后換新鮮培養(yǎng)基。

1.3.2 Real-time PCR和Western blot驗證PLK-1 siRNA干擾的效果 細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，然后用RIPA和Trizol分別提取蛋白和RNA。蛋白以GAPDH為內(nèi)參，用Western blot檢驗其表達差別。siRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后行Real-time檢測PLK-1 siRNA的轉(zhuǎn)錄水平差別。PLK-1和GAPDH的引物由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列

1.3.3 CCK-8檢測細胞增殖情況 經(jīng)不同PLK-1 siRNA干擾或者PBS作為對照的干擾組，6 h后，胰酶消化收集細胞，將其按96孔板每個孔2 000個細胞的密度接種，每次取5復孔，按4組要求分別加入正常葉酸濃度的培養(yǎng)基和不含葉酸的培養(yǎng)基后，分別培養(yǎng)72 h，然后棄去培養(yǎng)基，分別加入上述對應的培養(yǎng)基100 mL和CCK-810 μL的混合液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 3 h，檢測吸光度,觀察細胞增殖情況。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡和增殖情況 在6孔板轉(zhuǎn)染后，經(jīng)不同PLK-1siRNA干擾或者PBS作為對照的干擾組，干擾6 h后吸去干擾液，按4組要求分別加入正常葉酸濃度的培養(yǎng)基和不含葉酸的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h。收取上清液中的懸浮細胞+胰酶消化后的細胞，離心，PBS洗2次。然后按Annexin V試劑盒操作流程染色。實驗總共設一個陰性對照管、AnnexinV和PI單染管和實驗管，每管細胞約1×106。室溫避光孵育15 min，流式上機檢測細胞凋亡情況。對于周期，收集的各組細胞加入70%(PBS稀釋)-20 ℃無水乙醇2～3 mL，4℃固定6 h以上。1 500 r/min去上清，1 mL PBS 1 500 r/min 5 min清洗1遍，加入200 μL PBS重新懸浮，調(diào)整細胞濃度為106～107，加入1%的Rnase60 μL， 37 ℃搖床水浴30 min。加入20 μL 250 μg/mL的PI，室溫避光孵育10 min上機檢測。

1.3.5 Western blot檢測Bcl-2表達情況 RIPA提取蛋白后，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物研究所)測定蛋白濃度，調(diào)整濃度后用SDS上樣緩沖液加熱變性后，蛋白電泳檢測蛋白表達差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組PLK-1 mRNA水平和蛋白表達情況 轉(zhuǎn)染72 h后檢測PLK-1 mRNA和蛋白的表達情況。Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)胃癌細胞系SGC7901和BGC823，PLK-1 mRNA在用PLK-1 siRNA干擾的PLKS組較PBS干擾的PBS組明顯降低，見圖1。同樣，在蛋白表達水平上，Western blot顯示經(jīng)PLK-1 siRNA干擾，胃癌細胞系SGC7901和BGC823的PLK-1蛋白水平也明顯降低，見圖2及圖3。

圖1 SGC7901及BGC823 Real-time PCR結(jié)果

2.2 各組SGC7901和BGC823細胞增殖情況比較 在接種相同數(shù)目細胞的前提下，細胞數(shù)目少反映PLKS組細胞增殖較慢。析因方差分析顯示葉酸缺乏和PLK-1 siRNA對SGC7901和BGC823細胞增殖均有明顯影響，且葉酸缺乏和PLK-1 siRNA對胃癌細胞系SGC7901和BGC823有交互作用(P值分別為0.046和0.006)。因Null-PLKS組均數(shù)< Null-PBS組均數(shù)+Control-PLKS均數(shù)-Control-PBS組均數(shù)(SGC7901和BGC823細胞系計算值分別為0.227<0.316和0.309<0.485)，所以葉酸缺乏和PLK-1對胃癌細胞系SGC7901和BGC823的增殖抑制具有協(xié)同作用。見表2。

圖2 SGC7901 Western blot檢測結(jié)果

圖3 BGC823 Western blot檢測結(jié)果

表2 各組SGC7901和BGC823細胞增殖情況比較

2.3 各組SGC7901和BGC823細胞凋亡情況比較 Annexin V檢測細胞凋亡情況,流式圖橫坐標為標FITC的Annexin V,縱坐標為PI。SGC7901的早期凋亡(Q4象限)在Null-PLKS組、Null-PBS組、Control-PLKS組和Control-PBS組分別為(26.42±1.50)%，(5.13±1.24)%，(10.17±1.76)%和(6.17±2.47)%。BGC823的早期凋亡(Q4象限)在Null-PLKS組、Null-PBS組、Control-PLKS組和Control-PBS組分別為(24.28±2.90)%，(6.88±2.05)%，(13.30±2.58)%和(5.80±3.01)%。析因方差分析得出，PLK-1 siRNA能促進凋亡，但葉酸缺乏對凋亡影響不大；葉酸缺乏與PLK-1siRNA之間有交互效應。因Null-PLKS組均數(shù)< Null-PBS組均數(shù)+Control-PLKS均數(shù)-Control-PBS組均數(shù)(SGC7901和BGC823細胞系計算值分別為：26.42>9.13和24.28>14.38)，所以葉酸缺乏能增強PLK-1對胃癌細胞系SGC7901和BGC823的促凋亡作用。見圖4和圖5。

圖4 SGC7901細胞凋亡情況

圖5 各組BGC823細胞凋亡情況

2.4 各組SGC7901和BGC823細胞周期情況 SGC7901 G2/M比例在Null-PLKS組、Null-PBS組、Control-PLKS組和Control-PBS組分別為(20.88±2.55)%，(8.32±2.18)%，(19.49±1.98)%和(7.48±1.68)%；BGC823 G2/M比例在各組分別為(22.95±2.71)%，(11.61±2.66)%，(22.01±2.94)%和(10.03±2.47)%。對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)PLK-1 siRNA能提高G2/M比例(P<0.05)，但葉酸缺乏不能，而且葉酸缺乏和PLK-1 siRNA之間也無交互作用(P>0.05)。見圖6及圖7。

圖6 各組SGC7901細胞同期分布

2.5 各組SGC7901和BGC823細胞Bcl-2蛋白表達情況 葉酸缺乏和PLK-1 siRNA均能降低Bcl-2的表達，而且葉酸缺乏和PLK-1 siRNA對BCL-2的表達有交互效應(P<0.05)。鑒于兩者Null-PLKS組均數(shù) >Null-PBS組均數(shù)+Control-PLKS均數(shù)-Control-PBS組均數(shù),葉酸缺乏和PLK-1 siRNA具有拮抗作用。見圖8～10。

圖7 各組BGC823細胞同期分布

3 討 論

腫瘤是一個全身性疾病，手術對腫瘤尤其是中晚期腫瘤尤其是胃癌治療效果有限?；谀[瘤發(fā)生、發(fā)展機制的綜合治療，尤其是聯(lián)合治療有其特有的優(yōu)勢。

圖8 各組SGC7901細胞Bcl-2蛋白表達情況

圖9 各組BGC823細胞Bcl-2蛋白表達情況

圖10 SGC7901和BGC823 Bcl-2蛋白Western blot條帶灰度值柱狀圖

PLK-1作為PLK家族中被研究最多的一員，不僅在很多腫瘤中表達升高[8]，而且它的升高還對諸如胃癌、結(jié)直腸癌的預后判斷具有價值[9]。PLK-1參與了數(shù)個至關重要的有絲分裂步驟，如激活CDC25 c磷酸化酶[10]、調(diào)節(jié)有絲分裂過程[11]等。PLK-1具有參與多個腫瘤發(fā)生、發(fā)展步驟的特點。所以，PLK-1被認為是重要的分子靶標，并被廣泛關注[12]。Bcl-2是一個經(jīng)典的抗凋亡蛋白，降低Bcl-2能促進腫瘤凋亡，抑制腫瘤生長[13]。本實驗運用PLK-1的siRNA敲低PLK-1后，胃癌細胞系SGC7901和BGC823的增殖降低，凋亡增加，細胞阻滯在G2/M期， 且葉酸缺乏聯(lián)合PLK-1 siRNA能抑制Bcl-2的表達，提示降低PLK-1可能通過Bcl-2途徑起作用，這與其他研究的結(jié)果類似[5]。

葉酸是生物體代謝重要的一碳單位，葉酸類似物如甲氨蝶呤被用作腫瘤的治療[14]。本研究證實PLK-1 siRNA能抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡，葉酸缺乏也能抑制腫瘤的增殖，且葉酸能協(xié)同PLK-1 siRNA抑制腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡。但在抑制胃癌細胞Bcl-2的表達上有拮抗作用。筆者認為，這可能與蛋白的作用往往不是與濃度呈線性關系有關，該結(jié)果有待進一步研究。

葉酸缺乏和PLK-1 siRNA協(xié)同抑制腫瘤的意義在于，使用PLK-1抑制劑時補充葉酸，尤其是大量補充應慎重。不僅如此，PLK-1抑制劑聯(lián)合臨床使用的抗葉酸制劑，如甲氨蝶呤、普拉曲沙(pralatrexate)等，能否達到更好治療腫瘤的目的也值得深入研究。

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Study on folate deficiency and Polo-like kinase 1 (PLK-1) siRNA in synergistically inhibiting the growth of gastric carcinoma cell lines

ZHA Xiaoying1, HUANG Lei2, YANG Muqing1, OU Jingmin1, CHEN Dawei2, FEI Zhewei1

(1.Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China; 2.Xinhua Hospital Chongming Branch Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 202150, China)

Objective It is to approach the influence of the combination of folate deficiency and PLK-1 siRNA on the growth of gastric cancer cell lines.Methods After constructing PLK-1 siRNA in vitro, gastric carcinoma cell lines of SGC7901 and BGC823 were transfected with LipofectamineTM 2000.The PLK-1 transfected effect by siRNA was evaluated through detecting messenger RNA and protein of PLK-1 by real-time PCR and Western-blot, respectively.In addition, after transfecting with PLK-1 siRNA, these cell lines of SGC7901 and BGC823 were cultured in media with normal concentrations of folate or folate deficiency for 72 hours.Then, the changes of cell proliferation, apoptosis, cell cycle and the protein expressions of Bcl-2 were analyzed.Results Folate deficiency and PLK-1 siRNA inhibited the cell lines proliferation of SGC7901 and BGC823, induced apoptosis and made the cell cycle arrest at G2/M phase, synergistically.They could down regulate the Bcl-2 expression of SGC7901 and BGC823.Conclusions Folate deficiency and PLK-1 siRNA can inhibit the growth of SGC7901 and BGC823 synergistically.The effects may result from inhibiting the expression of BCL-2.

folate; gastric cancer cell lines; PLK-1; siRNA

查小應，男，住院醫(yī)師，從事胃腸外科臨床及實驗研究工作。

費哲為，E-mail：zheweifei@xinhuamed.com.cn

上海市衛(wèi)生局重點課題(20114030)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.09.002

R-33

A

1008-8849(2015)09-0917-04

2014-10-10