戴永建

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

癲癇發(fā)病中Rnd1-2蛋白的表達情況及意義

戴永建

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

目的 探討Rnd1-2蛋白在癲癇患者腦組織中的表達情況。方法 選擇癲癇手術(shù)患者36例作為研究組，同時選取12例顱腦創(chuàng)傷患者作為對照組。應(yīng)用免疫熒光、免疫組化以及Western-blot法檢測2組腦組織中Rnd1-2蛋白表達情況。結(jié)果 研究組顳葉腦組織中Rnd1-2蛋白的平均灰度顯著低于對照組(P<0.05)，陽性細胞數(shù)、光密度值均顯著高于對照組(P均<0.05)；免疫熒光檢測顯示，研究組Rnd1-2蛋白的陽性表達區(qū)域同神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性區(qū)域基本重疊。結(jié)論 Rnd1-2蛋白表達集中于神經(jīng)元，在癲癇的形成過程中有重要作用，對Rnd1-2蛋白的研究有助于闡明癲癇發(fā)病機制，有應(yīng)用及推廣價值。

Rnd1-2蛋白；癲癇；腦組織

國際抗癲癇聯(lián)盟定義部分丘腦、上位腦干灰質(zhì)神經(jīng)元、皮質(zhì)、深部核團突然性發(fā)作或者短暫異常放電，從而導(dǎo)致患者腦功能紊亂的現(xiàn)象為癲癇[1-2]。當(dāng)前國內(nèi)將癲癇定義為病因復(fù)雜，腦部神經(jīng)元發(fā)生異常放電現(xiàn)象，且具有高度同步化、反復(fù)發(fā)作、短暫性等特點，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂性綜合征?；颊呔唧w的臨床表現(xiàn)為運動、感覺、意識、情感、自主神經(jīng)、精神、認知以及記憶紊亂[3-4]，出現(xiàn)反復(fù)性的癲癇發(fā)作。特定的體征以及癥狀表現(xiàn)又被稱之為癲癇綜合征。突觸重構(gòu)即神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建是癲癇的主要發(fā)病機制之一。在中樞神經(jīng)的網(wǎng)絡(luò)重建中，Rho家族中Cdc42與Rac均起著積極的正性作用，并在突觸、生長錐以及發(fā)芽的形成中起到了十分積極的作用[5-6]。Rho家族屬于小分子GTP黏附蛋白，作為其亞家族，Rnd蛋白家族主要包括了Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rnd6等，其中Rnd1-2蛋白參與了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建，且發(fā)揮著十分重要的作用。為了進一步了解在癲癇的形成過程中Rnd1-2蛋白所起的作用，筆者檢測了36例癲癇手術(shù)患者及12例顱腦創(chuàng)傷患者腦組織中Rnd1-2蛋白表達情況，旨在探討其在癲癇發(fā)病機制中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2012年3月—2014年5月在本院行手術(shù)治療的36例癲癇患者作為研究組，男22例，女14例；年齡(29.4±9.2)歲?；颊呔习d癇診斷標(biāo)準，且均具有典型的腦電圖特征以及臨床表現(xiàn)，患者一般使用過卡馬西平、苯妥英鈉等抗癲癇藥物治療，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)血濃度為正常高限，患者治療后發(fā)作頻率未見顯著性減少；患者可尋病因不夠明顯，未見與癲癇有關(guān)的神經(jīng)功能缺損體征，經(jīng)詳細的病理檢查術(shù)后腦組織未見可引發(fā)癲癇發(fā)作的具體病因；經(jīng)腦MRI、CT檢查發(fā)現(xiàn)海馬硬化，但未見其他異?，F(xiàn)象；在術(shù)前通過硬膜下電極監(jiān)測，可見固定或者明確的癲癇放電部位，且手術(shù)適應(yīng)證明顯可進行手術(shù)治療；患者或者家屬對病情有所了解并同意簽署知情書。排除同時患有進行性神經(jīng)性疾病者，患有對治療有嚴重影響的急慢性疾病者，有精神病病史者，存在藥物或者乙醇濫用史者，患者本人或者家屬不同意者。另選擇同期收治顱腦創(chuàng)傷患者12例作為對照組，男7例，女5例；年齡(31.5±10.2)歲；均行減壓術(shù)。患者均無家族遺傳病史，無癲癇史或者其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病史，經(jīng)病理切片研究證實腦組織結(jié)構(gòu)均正常，且無明顯的低氧缺血損害表現(xiàn)，家屬均同意且簽署知情書。

1.2 檢測方法 取2組患者顳葉腦組織進行Rnd1-2檢測。

1.2.1 免疫組化檢測 對組織切片行脫蠟抗原熱修復(fù)處理，將收集到的血清封閉液進行封閉，加入USCN公司的兔抗人Rnd1-2蛋白多克隆一抗，4 ℃孵育過夜，經(jīng)DAB顯色處理，并應(yīng)用蘇木精復(fù)染，最后使用中性樹脂進行封固，若胞膜與胞質(zhì)染成棕黃色則視為陽性。每例樣本取10張切片，隨機選取其中3張行免疫組化處理，在高倍鏡下對每張切片隨機選取10個視野計數(shù)對陽性細胞數(shù)；應(yīng)用北航CM-2000B彩色病理分析系統(tǒng)測定平均灰度值。

1.2.2 雙重免疫熒光檢測 對組織切片行脫蠟抗原熱修復(fù)處理，隨后滴加1%的牛血清白蛋白，并加入0.4%Triton，于室溫下放置約1 h，再用山羊血清封閉液進行封閉處理5 h，保證對特異性抗原進行充分封閉。隨后加入Rnd1-2蛋白一抗及NSE工作液(北京中杉提供)4 ℃孵育過夜，再分別依次加入山羊抗兔二抗(綠色熒光標(biāo)記，北京中杉提供)與山羊抗小鼠二抗(紅色熒光標(biāo)記，北京中杉提供)，均在室溫下進行避光孵育1 h，最后經(jīng)PBS充分沖洗后終止反應(yīng)，經(jīng)PBS混合液封固處理，使用共聚焦顯微鏡(Leica TCS-SP2)觀察結(jié)果。

1.2.3 Western-blot檢測 取樣品16 μL，隨后加入上樣緩沖液約4 μL，在沸水中將混勻后的樣品煮約3 min使蛋白發(fā)生變性，再加入電泳液并準備上樣；調(diào)整電泳，電壓調(diào)至120 V，電泳處理至跑出溴酚藍則即刻終止，然后取出膜，同時做好標(biāo)記，需注意正反面，隨后采用TBST進行清洗約1 min，最后使用封閉液封閉過夜，再使用封閉液將相應(yīng)一抗稀釋成一定濃度(1∶1 000),室溫孵育1.5 h,TBST清洗3次，100 min/次，最后在暗室中將膠依發(fā)光強度選擇曝光程度顯影。

2 結(jié) 果

2.1 2組平均灰度及陽性細胞數(shù)比較 研究組顳葉腦組織中Rnd蛋白1-2的平均灰度值為127.63±6.24，對照組為173.76±3.82，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究組陽性細胞數(shù)(30.21±3.44)個，對照組(11.17±0.65)個，2組神經(jīng)元細胞內(nèi)均能夠見到棕黃色的陽性顆粒，主要分布在細胞質(zhì)與細胞膜中，同時發(fā)現(xiàn)研究組神經(jīng)細胞軸突當(dāng)中陽性顆粒聚集十分明顯。見圖1及圖2。

圖1 研究組顳葉腦組織Rnd1-2蛋白表達情況(×400)

圖2 對照組顳葉腦組織Rnd1-2蛋白表達情況(×400)

2.2 雙重免疫熒光檢測結(jié)果 雙重免疫熒光圖片可見研究組患者腦組織中Rnd1-2(標(biāo)記綠色)與NSE(標(biāo)記紅色)有共同表達，見圖3～5；而在其他區(qū)域卻少見Rnd1-2蛋白的單獨陽性表達。

圖3 Rnd1-2蛋白陽性表達情況

圖4 NSE陽性表達情況

2.3 Western-blot檢測結(jié)果 研究組Rnd1-2蛋白光密度比值為0.51±0.04，對照組為0.21±0.01，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.902，P=0.003)。

3 討 論

癲癇病理學(xué)異常多為組織出現(xiàn)局部性神經(jīng)元丟失或者變性，甚至發(fā)生膠質(zhì)化細胞的結(jié)節(jié)以及增生?；颊叩纳窠?jīng)系統(tǒng)針對這種情況會做出神經(jīng)突觸重組的反應(yīng)，重新所產(chǎn)生的一種反應(yīng)神經(jīng)元環(huán)路，但會刺激神經(jīng)元，增加其興奮性，該現(xiàn)象被稱為癲癇芽生。在正常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中，神經(jīng)元之間需要靠多種聯(lián)系方式來建立信號，尤其是依賴突觸。在癲癇患者的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中，因為諸多因素，最終造成患者的神經(jīng)突觸發(fā)生了斷裂，并引發(fā)了軸突芽生，進一步在多種分子的導(dǎo)向下，使軸突伸長并與新的神經(jīng)突觸重新建立突觸關(guān)系，從而形成新的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致癲癇的反復(fù)發(fā)作。癲癇的形成與以突觸芽生為基礎(chǔ)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建有密切關(guān)系[7-8]。Rnd1-2蛋白在突觸的生長與導(dǎo)向以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成中發(fā)揮了重要且積極的作用。Rnd1-2蛋白基因的編碼位于12號染色體長臂q12-13，主要分布在大腦皮質(zhì)與海馬錐體細胞中；而神經(jīng)細胞的亞細胞部位則主要集中Rnd1-2蛋白，多分布于細胞質(zhì)與突觸體膜中，Rnd1-2蛋白的激活也是經(jīng)由表達水平提升來實現(xiàn)的。

圖5 Rnd1-2及NSE共同表達區(qū)域

本研究發(fā)現(xiàn)癲癇患者的顳葉腦組織Rnd1-2蛋白表達有所上調(diào)，神經(jīng)細胞中呈現(xiàn)褐色的Rnd1-2蛋白陽性區(qū)域主要就分布在細胞膜與細胞膜附近，而對照組中陽性表達則不具有這樣明顯的趨勢，由此說明不同亞細胞部位的滯留現(xiàn)象可能是Rnd1-2蛋白最終實現(xiàn)其激活的一種方式，這與目前一些動物模型研究相吻合[9-10]。這些研究均表明Rnd1-2蛋白存在一個向細胞膜轉(zhuǎn)移的激活程序。為了能更好地了解癲癇腦組織細胞分布情況，筆者又進行了雙重免疫熒光檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rnd1-2蛋白與NSE有共同表達，但其他的區(qū)域卻很少發(fā)現(xiàn)Rnd1-2蛋白的單獨陽性表達。由于NSE的特異性表達主要在神經(jīng)元，可見Rnd1-2蛋白也主要表達于神經(jīng)細胞。

生長錐在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建中對軸突與樹突的生長與方向起著決定作用，而生長錐功能出現(xiàn)異常，很可能是癲癇發(fā)生及發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[11]。Burneo等[12]研究證實了Rnd1-2蛋白可以與Plexin-A1與Plexin-B1作用，并將軸突導(dǎo)向的一個排斥因子(Semaphorins)信號所轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，Rnd1-2蛋白信號途徑會通過對樹突棘產(chǎn)生刺激而導(dǎo)致異常網(wǎng)絡(luò)的形成，這與上述觀點基本一致。

綜上所述，癲癇患者的顳葉腦組織中可見Rnd1-2蛋白表達上調(diào)，耐藥癲癇患者的神經(jīng)異常網(wǎng)絡(luò)形成是最為顯著的病理改變，而Rnd1-2蛋白通過對生長錐的調(diào)節(jié)并最終參與了癲癇異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成過程，并在癲癇的發(fā)病機制中起到了作用，通過對Rnd1-2蛋白進行調(diào)控，可能成為新的抗癲癇治療靶點。

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Study on the significance and expression of Rnd protein 1-2 in epilepsy

DAI Yongjian

(The People’s Hospital Affiliated to Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to investigate the expression of Rnd protein 1-2 in the brain tissue of patients with epilepsy. Methods 36 cases of epilepsy patients were selected for study group, and 12 cases of of cerebral trauma patients as control group, the expression of Rnd protein 1-2 in brain tissue were detected by immunofluorescence, immunohistochemistry and Western-blot method in both groups. Results The average gray worth of temporal lobe brain tissue was (127.63±6.24) in study group and was (173.76±3.82) in control group, there was significant difference between both groups (P<0.05). The number of positive cells was (30.21±3.44) in study group and was (11.17±0.65) in control group, the optical density value was (0.51±0.04) in study group and was (0.21±0.01) in control group, there were significant differences between both groups (P<0.05). Immunofluorescent assay showed that the regional of positive expression of Rnd protein 1-2 and the positive regional of neural asexual enolase specific namely NSE was basic overlap in study group.Conclusion The expression of Rnd protein 1-2 is mainly focus on neurons, it play an important role in the formation of epilepsy. The study on Rnd protein 1-2 is contributed to elucidate the pathogenesis of epilepsy; it has the value of application and popularization.

Rnd protein 1-2; epilepsy; brain tissue

戴永建，男，主治醫(yī)師，研究方向為癲癇的發(fā)病機制及外科治療。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.003

R749.17

A

1008-8849(2015)12-1261-03

2014-10-15