黃桂華 梁坤南 周再知 馬華明 杜健

(中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州，510520)

柚木無性系苗期抗寒生理評(píng)價(jià)與選擇1)

黃桂華 梁坤南 周再知 馬華明 杜健

(中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州，510520)

以不同柚木無性系盆栽苗為研究對(duì)象，分別進(jìn)行6 ℃培養(yǎng)24 h，接著3 ℃培養(yǎng)24 h，在低溫冷害處理前后分別取葉樣進(jìn)行了相對(duì)電導(dǎo)率、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定，分析了低溫冷害對(duì)柚木生理的影響，綜合評(píng)價(jià)了不同柚木無性系的抗寒性。結(jié)果表明，除了SOD活性在6 ℃處理下不同柚木無性系間沒有顯著差異外，不同柚木無性系間3個(gè)生理指標(biāo)在處理前后都達(dá)到顯著或極顯著差異水平；冷害處理后，柚木無性系相對(duì)電導(dǎo)率和游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本呈上升趨勢(shì)，SOD活性則有的無性系先上升后下降，有的無性系先下降后上升；部分柚木無性系通過增加游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和SOD活性來提高自身的抗寒性；綜合評(píng)定抗寒性強(qiáng)的柚木無性系有7559、7531、Z408，其次較耐寒的柚木無性系有7509、7544和7514；緬甸種源抗寒性高于印度種源。

柚木；無性系；生理響應(yīng)；抗寒性；早期選擇

柚木(TectonagrandisL. f.)是世界名貴的用材樹種，素有“萬木之王”的美稱；其心材呈黃褐色或暗褐色，材質(zhì)堅(jiān)韌耐久，結(jié)構(gòu)致密美觀，是制造軍艦、建筑、家具、雕刻和木地板等的高級(jí)用材[1]。柚木具有生長(zhǎng)快，材質(zhì)優(yōu)良，用途廣和投資回報(bào)率高等特點(diǎn)，在熱帶、南亞熱帶地區(qū)廣為種植[2-3]?，F(xiàn)在，柚木已被引種到亞洲、非洲、中南美洲和大洋洲的50多個(gè)國家，范圍從北緯28°，穿越赤道，到南緯18°[4]。

我國引進(jìn)柚木栽培已有180多年歷史，種植范圍遍及10個(gè)省(自治區(qū))60多個(gè)縣(市)，總面積約1.5萬hm2[5]。近年來，云南省、海南省把柚木列為主要造林樹種，海南、云南、廣東、廣西等私人與企業(yè)采用柚木造林的也越來越多。然而，柚木作為一個(gè)外來引進(jìn)的熱帶樹種，在我國廣東、廣西、福建等一些次適生區(qū)，柚木苗期或1～3年生幼林期，越冬若遇到持續(xù)的霜凍或2 ℃以下的低溫，則會(huì)出現(xiàn)冷害或凍害現(xiàn)象，頂芽、植株中上部甚至整株死亡[6-8]。因此，寒害是制約我國柚木發(fā)展面臨的難題，導(dǎo)致柚木在我國的發(fā)展地理區(qū)域面積有限，也受到極端低溫氣候的風(fēng)險(xiǎn)，基于此，盡快選育出更加抗寒的柚木優(yōu)良新品系，是大力發(fā)展柚木種植業(yè)面臨的一個(gè)迫切需要解決的現(xiàn)實(shí)問題。

前期結(jié)果表明，柚木不同種源、不同無性系在抗寒性方面有較大遺傳差異[8-9]，這為柚木抗寒育種提供了廣闊的空間。林木生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，僅靠大田測(cè)定結(jié)果，育種效率低?，F(xiàn)代研究人員常利用生理生化或分子生物學(xué)技術(shù)手段，可對(duì)林木測(cè)定材料開展苗期甚至各個(gè)生長(zhǎng)階段的評(píng)價(jià)進(jìn)行早期選擇，從而縮短育種時(shí)間，提高評(píng)估和育種效率。He et al.[10]研究了福建柏抗寒生理指標(biāo)變化，為福建柏抗寒種源的選擇和引種北移提供了科學(xué)依據(jù)。張富山等[11]針對(duì)科羅拉多云杉不同種源選擇測(cè)定了6個(gè)生理指標(biāo)，研究得出種源間抗寒性由強(qiáng)到弱順序?yàn)榭屏_拉多霧藍(lán)、科羅拉多藍(lán)杉、科羅拉多凱巴。張衛(wèi)華等[12]評(píng)估了相思在樹種和種源水平上的耐寒性，認(rèn)為大葉相思和厚莢相思低溫敏感溫度為0～3 ℃，二者抗寒性強(qiáng)于馬占相思，并分別選擇出了3個(gè)樹種耐寒的種源。本研究擬進(jìn)行柚木無性系盆栽苗期冷害脅迫，測(cè)定分析各項(xiàng)生理指標(biāo)，以便了解柚木無性系的抗寒機(jī)理，最后綜合評(píng)價(jià)各無性系的抗寒性差異，輔助柚木優(yōu)良無性系選育，以期早期選擇出一批抗寒性強(qiáng)的柚木優(yōu)良無性系，縮短育種周期，為我國柚木種植業(yè)的大力發(fā)展提供栽培材料的保證。

1 材料與方法

選擇了21個(gè)柚木組培無性系，在中國林科院熱帶林業(yè)研究所苗圃分別移植成活7個(gè)月后，移入塑料育苗盆進(jìn)行盆栽，基質(zhì)為1 500 g的黃心土，同時(shí)以柚木種子園的優(yōu)良家系種子培育同齡實(shí)生苗盆栽為對(duì)照，共22個(gè)號(hào)(表1)，文中編號(hào)和名稱采用最初生產(chǎn)及大田試驗(yàn)林的統(tǒng)一編號(hào)，每盆1株，每個(gè)無性系3盆。

表1 參試柚木無性系及其來源

盆栽5個(gè)月時(shí)，對(duì)每株進(jìn)行取樣分析低溫冷害處理前的生理指標(biāo)，剪取每株的從上往下數(shù)第3對(duì)成熟葉片，取樣后迅速回到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生理分析或分裝于液氮中保存。然后，將所有植株置于人工氣候箱進(jìn)行低溫培養(yǎng)，設(shè)計(jì)從常溫開始每小時(shí)降3 ℃，降到6 ℃時(shí)，保持培養(yǎng)24 h，之后同樣對(duì)每株采集葉樣進(jìn)行生理分析；接著降到3 ℃保持培養(yǎng)24 h，對(duì)每株采集葉樣進(jìn)行生理分析。人工控制培養(yǎng)時(shí)，光照強(qiáng)度為1 200 lx，光照時(shí)間為12 h，相對(duì)濕度保持在70%～80%。

測(cè)定的生理指標(biāo)包括相對(duì)電導(dǎo)率、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。電導(dǎo)率的測(cè)定參照陳建勛等[13]的方法，游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參照郝再彬[14]的方法，SOD活性的測(cè)定參照Giannopolitis et al.[15]的方法。測(cè)定時(shí)，每個(gè)樣品每個(gè)指標(biāo)待數(shù)值穩(wěn)定后記錄3次。

用Excel計(jì)算出每個(gè)樣品每個(gè)指標(biāo)測(cè)定3次數(shù)據(jù)的平均值，然后采用SAS軟件程序進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較。應(yīng)用多維空間(歐幾米德)多向量綜合評(píng)定法進(jìn)行無性系抗寒性的綜合評(píng)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷害后柚木無性系的生長(zhǎng)情況觀察

柚木無性系冷害發(fā)生后，冷害特征首先表現(xiàn)在頂芽和葉片上。本試驗(yàn)柚木無性系在6 ℃培養(yǎng)24 h后，無性系7509、7514、8301、7559和CK有3株頂芽或少量葉片保持完好，其他無性系部分葉片及頂芽萎蔫。3 ℃培養(yǎng)24 h后，上述冷害特征更加嚴(yán)重，無性系7509、7514、8301、7559和CK有3株頂芽完好，7531、Z408、7555、7544有2株頂芽完好，其他無性系幾乎所有頂芽和大部分葉片出現(xiàn)萎蔫甚至干枯現(xiàn)象，干枯的葉片主脈及其兩側(cè)保持綠色。此次冷害培養(yǎng)處理的人工氣候箱有較大的循環(huán)冷風(fēng)，冷害脅迫對(duì)頂芽、嫩葉和老葉同時(shí)造成傷害。

本試驗(yàn)冷害處理結(jié)束后對(duì)所有參試柚木無性系植株恢復(fù)常溫和正常管護(hù)，大部分無性系的頂芽和葉片受冷害后都枯萎或凋落。無性系7210、7122、7412和3078-5各有1株死亡，其他無性系都能在1個(gè)星期后萌生側(cè)芽，開始正常生長(zhǎng)。

2.2 冷害后柚木無性系葉片生理指標(biāo)的響應(yīng)

2.2.1 冷害后柚木無性系相對(duì)電導(dǎo)率的響應(yīng)

對(duì)冷害處理前后柚木無性系的相對(duì)電導(dǎo)率數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，處理前柚木無性系間的相對(duì)電導(dǎo)率有顯著差異(P=0.036 7)，3 ℃冷害后則達(dá)到了極顯著差異(P=0.008 5)。從處理前后的數(shù)據(jù)變化(表2)來看，隨著冷害脅迫溫度的降低，柚木無性系的相對(duì)電導(dǎo)率主要呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，說明低溫冷害使細(xì)胞膜受傷害，破壞了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，膜透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)電解質(zhì)外滲，從而相對(duì)電導(dǎo)率升高，并且冷害溫度越低，細(xì)胞膜透性變得越大，膜受傷害的程度越強(qiáng)。

值得注意的是，無性系7559、7531和Z408等隨著冷害溫度的降低，相對(duì)電導(dǎo)率變化不大。分析其原因，可能是這些無性系具有很強(qiáng)的抗寒性，低溫(冷馴化)使其啟動(dòng)了自身的避寒或耐寒機(jī)制，細(xì)胞膜沒有受到傷害。從處理后相對(duì)電導(dǎo)率與處理前的比值來看，柚木無性系經(jīng)歷3 ℃冷害處理后，相對(duì)電導(dǎo)率變化幅度從小到大依次是7559、7531、Z408、7219、7412、CK和7509，說明它們的細(xì)胞膜受到破壞或破壞程度從小到大也是這個(gè)順序，因此，早期選擇以20%的入選率，可以認(rèn)為7559、7531、Z408和7219屬于抗寒性強(qiáng)的柚木無性系，其次為7412、7509。相反，71-5、7114、108、7122、3078-5和7210為柚木無性系抗寒性弱。

表2 柚木無性系冷害后電導(dǎo)率的鄧肯多重比較

2.2.2 冷害后柚木無性系游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的響應(yīng)

植物遇到冷害、干旱等逆境條件時(shí)，體內(nèi)會(huì)大量積累脯氨酸，脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以減少植物在逆境中受到的傷害，從而提高植物抵抗低溫脅迫等的能力[16]。方差分析表明，處理前(P<0.000 1)和處理后(6 ℃，P=0.000 4；3 ℃，P<0.000 1)柚木無性系間的脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)都有極顯著差異。從處理前后脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)值的變化(表3)來看，隨著低溫脅迫的加劇，大部分柚木無性系啟動(dòng)了自我生理保護(hù)機(jī)制，通過脯氨酸的合成和積累提高自身的抗寒性，積累的越多，說明抗寒性越強(qiáng)。從處理后與處理前脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比值來看，以20%的入選率，可知7531、CK、7137、7514、Z408抗寒較強(qiáng)，其次為7219、7509，而無性系7146、7013、7029、71-5、7122、7210不抗寒。

2.2.3 冷害后柚木無性系超氧化物歧化酶活性的響應(yīng)

超氧化物歧化酶(SOD)是細(xì)胞抵御活性氧傷害的膜保護(hù)系統(tǒng)，在清除超氧自由基、過氧化氫和過氧化物及阻止或減少羥基自由基形成方面起重要作用[17-18]。在低溫脅迫下，植物細(xì)胞自由基產(chǎn)生會(huì)傷害細(xì)胞膜系統(tǒng)，因此，SOD活性的高低反映了植物對(duì)低溫等逆境抵御能力的大小。對(duì)低溫冷害處理前后柚木無性系SOD活性進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，處理前柚木無性系間的SOD活性有極顯著差異(P<0.000 1)，而6 ℃冷害處理后，柚木無性系間的SOD活性差異不顯著。比較處理前后SOD活性數(shù)據(jù)(表4)可知，部分無性系正常生長(zhǎng)情況下SOD活性較低(如7509和7544)，經(jīng)過6 ℃冷害處理后，SOD活性增加了；另一些無性系正常生長(zhǎng)情況下SOD活性較高(如71-5和7114)，經(jīng)過6 ℃冷害處理后，SOD活性減少了；最后還有一部分柚木無性系(如7013和7137)SOD活性變化或增減很小?？梢姴煌帜緹o性系對(duì)6 ℃低溫的敏感程度不一樣，這也體現(xiàn)出了無性系間抗寒性不一樣，有的柚木無性系生長(zhǎng)對(duì)6 ℃低溫敏感，有的柚木無性系生長(zhǎng)對(duì)6 ℃冷害不敏感。3 ℃冷害處理后，不同柚木無性系的SOD活性又有極顯著差異(P<0.000 1)，說明此時(shí)柚木無性系間的SOD活性又因更低溫度的脅迫而發(fā)生了急劇的變化，3 ℃冷害是柚木無性系生長(zhǎng)的更為敏感的溫度。

表3 柚木無性系冷害后游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鄧肯多重比較

表4 柚木無性系冷害后SOD活性的鄧肯多重比較

低溫脅迫后，部分柚木無性系通過提高SOD活性來調(diào)節(jié)提高自身的抗寒性，體內(nèi)SOD活性越高，說明其抗寒性越強(qiáng)。從處理后SOD活性與處理前的比值來看，7544、7509、Z408等柚木無性系處理后SOD活性明顯增加，且隨著脅迫的加劇，SOD活性增加量更高，因此，以20%的入選率，可以認(rèn)為7544、7509、Z408、7137柚木無性系抗寒性強(qiáng)，其次為7514、7531、7555。相反，柚木無性系71-5、7114、7146、7412、7219、108、7013、7210抗寒性弱。

2.3 柚木無性系抗寒性的綜合評(píng)定

采用歐幾米德多向量理論綜合評(píng)定法對(duì)柚木無性系3 ℃(柚木生長(zhǎng)敏感溫度)處理后的生理指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評(píng)估柚木無性系間的抗寒性(表5)，可知比CK抗寒性強(qiáng)的柚木無性系只有7559，以20%的入選率，其次相對(duì)較耐寒的柚木無性系有7531、Z408、7509。

表5 歐幾米德多向量理論綜合評(píng)定柚木無性系抗寒性

3 結(jié)論與討論

植物生長(zhǎng)過程中遇到低溫冷寒等逆境時(shí)，其體內(nèi)生理活動(dòng)會(huì)發(fā)生一系列的復(fù)雜連鎖反映，這既和外部環(huán)境條件有關(guān)，也和自身的抗逆特性有密切關(guān)系。通過人工模擬林木自然生長(zhǎng)可能發(fā)生的逆境條件，利用林木生理生化在逆境條件下的這種內(nèi)在規(guī)律性響應(yīng)，對(duì)林木測(cè)定材料開展苗期甚至各個(gè)生長(zhǎng)階段的評(píng)價(jià)，取得了一系列的成果。烏風(fēng)章等[19]研究了低溫脅迫對(duì)白樺生長(zhǎng)和生理的影響，馮獻(xiàn)賓等[20]研究了低溫脅迫對(duì)黃連木抗寒生理指標(biāo)的影響，李晶等[21]研究了低溫脅迫下紅松幼苗活性氧的產(chǎn)生及保護(hù)酶的變化。上述研究都達(dá)到了預(yù)期的目標(biāo)。

值得注意的是，生理指標(biāo)的選擇非常關(guān)鍵，單用一個(gè)指標(biāo)很難說明植物復(fù)雜的抗性數(shù)量性狀；只有采用多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，才能客觀地反映植物的抗寒生理過程；但也不是指標(biāo)越多越好，而且根據(jù)不同樹種特性，指標(biāo)選擇會(huì)有所不同。張衛(wèi)華等[22]評(píng)估相思的抗旱性時(shí)測(cè)定了9個(gè)生理指標(biāo)，主成分分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)電導(dǎo)率、水分指標(biāo)、游離脯氨酸和可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)占了影響因子的88.64%，其中相對(duì)電導(dǎo)率又是最主要的影響因子。馮建燦等[23]研究了低溫脅迫對(duì)喜樹幼苗SOD活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度和脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，認(rèn)為葉片內(nèi)脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低可作為衡量喜樹抗寒性指標(biāo)。Zhou et al.[24]研究過柚木無性系，測(cè)定了CHL、SPRO、SOD、POX和MDA五個(gè)生理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)SOD活性適合作為評(píng)價(jià)柚木無性系抗寒性的生理指標(biāo)。本研究作者前期試驗(yàn)通過生理指標(biāo)測(cè)定過一批柚木無性系的抗寒性，測(cè)定的指標(biāo)包括相對(duì)電導(dǎo)率、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、SOD活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度和可溶性糖、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、SOD活性更加符合柚木無性系大田寒害調(diào)查的結(jié)果(未發(fā)表)，三者適合作為柚木生理評(píng)價(jià)的指標(biāo)體系。

據(jù)報(bào)道，抗寒性強(qiáng)的柚木無性系可耐2 ℃的最低溫[24]，一般持續(xù)0 ℃或霜凍后即出現(xiàn)嚴(yán)重的凍害死亡現(xiàn)象。本研究合理地選擇了6 ℃和3 ℃進(jìn)行無性系早期評(píng)估和篩選研究。從冷害處理前后柚木無性系間相對(duì)電導(dǎo)率的數(shù)值變化和方差顯著性來看，在6 ℃低溫處理后，柚木無性系即已經(jīng)對(duì)冷害產(chǎn)生了明顯的生理反應(yīng)，而3 ℃低溫冷害后柚木無性系間的相對(duì)電導(dǎo)率差異顯著增加，則說明了3 ℃是柚木生長(zhǎng)的敏感溫度，長(zhǎng)時(shí)間在3 ℃及以下環(huán)境，柚木葉片因冷害而導(dǎo)致細(xì)胞受損，生長(zhǎng)必將受到抑制，甚至葉片和頂芽脫落，更嚴(yán)重時(shí)植株頂端甚至整株死亡。SOD活性也印證了對(duì)柚木生長(zhǎng)來說，3 ℃是比6 ℃更為敏感的溫度，而6 ℃是柚木冷害生理反應(yīng)溫度。低溫脅迫后，部分柚木無性系通過增加游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和SOD活性來調(diào)節(jié)提高自身的抗寒性，但如果隨著溫度繼續(xù)降低，低溫脅迫已超過了其自身調(diào)節(jié)能力，就會(huì)出現(xiàn)冷害甚至凍害。

本研究分析了冷害處理前后柚木無性系相對(duì)電導(dǎo)率、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和SOD活性3個(gè)生理指標(biāo)的變化過程的基礎(chǔ)上，從單個(gè)指標(biāo)評(píng)定了柚木無性系的抗寒性，最后在3個(gè)指標(biāo)的基礎(chǔ)上，采用歐幾米德多向量理論綜合評(píng)定法綜合評(píng)定了不同柚木無性系間的抗寒性，初步篩選出抗寒性強(qiáng)的柚木無性系7559、7531、Z408，其次較耐寒的柚木無性系有7509、7544和7514。本研究所篩選出來的耐寒柚木無性系均選自緬甸種源，這和李運(yùn)興等[8]報(bào)道的緬甸種源抗寒性高于印度種源的結(jié)果一致。

然而，從單個(gè)測(cè)定的3個(gè)生理指標(biāo)來看，相對(duì)電導(dǎo)率和游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析結(jié)果認(rèn)為，無性系7137和7219抗寒性都較強(qiáng)，SOD活性的分析結(jié)果認(rèn)為，無性系7137抗寒性較強(qiáng)，而7219不抗寒；綜合評(píng)定的結(jié)果中，7137抗寒性排第6，7219抗寒性排第9。故認(rèn)為，7137和7219可能是印度種源無性系中相對(duì)抗寒的無性系，但這也有待進(jìn)一步的研究或大田的寒害調(diào)查結(jié)果來加以驗(yàn)證。但總的來說，選自印度種源的柚木無性系不抗寒，對(duì)立地氣候溫度條件的要求較高。因此，本研究為柚木無性系的推廣應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Chilling Physiological Estimate and Early Selection ofTectonagrandisL. f. Clones at Seedling Stage//

Huang Guihua, Liang Kunnan, Zhou Zaizhi, Ma Huaming, Du Jian

(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2015,43(9)：12-17.

The potted seedlings of different teak (TectonagrandisL. f.) clones were cultured at 6 ℃ for 24 h, and then 3 ℃ for 24 h to estimate chilling resistance of different teak clones, and the relative conductivity (EC), free proline (FPRO) content and superoxide dismutase (SOD) activity were measured for leaves of each tree before and after treatments. Three physiological indexes had significant and highly significant difference between teak clones before and after treatments except SOD activity after the treatment of 6 ℃ for 24 h. The relative conductivity and free proline content increased after chilling stress, SOD activity increased for some clones first, and then decreased, while others were inverse. Some teak clones became more cold resistant by increasing FPRO content and SOD activity. The teak clones 7559, 7531 and Z408 were screened by chilling resistance capacity, followed by clones 7509, 7544 and 7514. Myanmar teak provenances have higher chilling tolerance than India teak provenances.

TectonagrandisL. f.; Clone; Physiological response; Chilling resistance; Early selection

1)國家“十二五”科技支撐項(xiàng)目(2012BAD21B01)。

黃桂華，男，1979年8月生，中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，副研究員。E-mail:hghcom@sina.com。

梁坤南，中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，研究員。E-mail:chinateak@163.net。

2015年3月11日。

S723.1+33；Q945.78

責(zé)任編輯：任 俐。