譚　艷(綜述)，范立青(審校)

(1.中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所，長(zhǎng)沙 410078； 2.株洲市婦幼保健院生殖科，湖南 株洲 412000)

精子DNA損傷對(duì)生殖結(jié)局影響的研究進(jìn)展

譚艷1,2△(綜述)，范立青1※(審校)

(1.中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所，長(zhǎng)沙 410078； 2.株洲市婦幼保健院生殖科，湖南 株洲 412000)

摘要：人類精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性是影響精子生育能力和子代安全性的重要因素，與生殖結(jié)局密切相關(guān)，可導(dǎo)致并預(yù)測(cè)男性不育及自然流產(chǎn)，亦可評(píng)估人工授精(IUI)的預(yù)后情況，并且影響體外受精-胚胎移植(IVF-ET)及卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的受精率、著床率、妊娠率、活產(chǎn)率等。而精子DNA損傷的增加與流產(chǎn)的增加有關(guān)，對(duì)后代健康的不良影響也是通過DNA損傷的精子遺傳的，因此，精子DNA損傷閾值的確定對(duì)改善輔助生殖的治療結(jié)局非常重要。

關(guān)鍵詞：精子；DNA損傷；染色質(zhì)；生殖結(jié)局；閾值

不孕不育大約影響15%的育齡夫婦，其中25%～40%存在男性因素的不育[1]。在過去的100余年，男性不育的臨床診斷主要依賴于MacLeod和Gold最初建立的精液分析法與評(píng)價(jià)體系[2]。然而，人類精液分析在預(yù)測(cè)男性生育能力或生育結(jié)局方面還存在明顯的不足，近年來精子DNA損傷的評(píng)估在分子水平上解決了這一問題。精子DNA損傷被證實(shí)對(duì)男性不育和輔助生殖結(jié)局是有價(jià)值的生物標(biāo)志物，并可診斷預(yù)后，它與降低受精率、胚胎質(zhì)量、妊娠率以及較高的流產(chǎn)率和兒童疾病相關(guān)聯(lián)[3]。精子DNA損傷是精液質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，它的常規(guī)檢測(cè)將改善輔助生殖技術(shù)的成功率?，F(xiàn)就精子DNA損傷對(duì)生殖結(jié)局影響的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1精子染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)

精子染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)具有雙重功能，不僅在儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)铰涯讣?xì)胞的過程中保護(hù)DNA免受損傷，而且在卵漿中能快速完整地打開未損傷的父源基因。在精子的形成過程中，DNA的包裝與體細(xì)胞不同，所有的組蛋白均被過渡蛋白替代，接著被魚精蛋白替代，魚精蛋白作為精子染色質(zhì)的主要結(jié)合蛋白，在正確包裝父源DNA過程中起關(guān)鍵作用，其將DNA折疊成緊密封裝的螺線管，每個(gè)螺線管約有50 kb DNA，當(dāng)魚精蛋白添加到DNA時(shí)，這些螺線管在體外以漸進(jìn)方式形成，整個(gè)過程使染色質(zhì)凝集得十分緊密，形成一個(gè)幾乎無水的晶體結(jié)構(gòu)，缺水對(duì)于減少DNA損傷非常重要；組織結(jié)構(gòu)的任何異常變化都會(huì)導(dǎo)致父源DNA傳遞的延誤或缺陷，除此之外，精子從睪丸到達(dá)卵母細(xì)胞的過程中，DNA的任何損傷均不可修復(fù)，直到進(jìn)入卵漿中的DNA修復(fù)系統(tǒng)；精子染色質(zhì)高于或低于正常的壓實(shí)和穩(wěn)定均會(huì)增加DNA易損性，而且一些組蛋白仍存在于完全成熟的精子端粒體、基質(zhì)附著區(qū)等位置，這樣的DNA更容易受毒素?fù)p傷[4]。

2精子DNA損傷的機(jī)制和影響因素

2.1損傷機(jī)制引起精子DNA損傷的機(jī)制尚不完全清楚，主要包括：①成熟精子中活性氧誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA缺口，這是精子染色質(zhì)損傷的主要原因；②失敗的生精細(xì)胞凋亡；③在生精過程核蛋白組型變換時(shí)，拓?fù)洚悩?gòu)酶產(chǎn)生的缺口修復(fù)失敗[5]。

2.2影響因素

2.2.1環(huán)境毒物多種化學(xué)產(chǎn)品可能損傷精子的染色質(zhì)。研究表明，環(huán)境中的殺蟲劑和甲胺磷[6]與精子染色質(zhì)完整性呈負(fù)相關(guān)，電子電器產(chǎn)品中的四溴雙酚A會(huì)增加精子DNA碎片(sperm DNA fragmentation,SDF)[7]。近期發(fā)現(xiàn)，手機(jī)射頻電磁場(chǎng)[8]和無線網(wǎng)絡(luò)連接[9]對(duì)精子的活力和DNA完整性也有影響。特殊環(huán)境及職業(yè)人群的SDF 指數(shù)(DNA fragmentation index，DFI)顯著增高，如司機(jī)、高溫或有毒環(huán)境工作的工人[10]。

2.2.2生理病理因素年齡是影響精子染色質(zhì)完整性的重要因素，隨著年齡的增加，凋亡精子和SDF的百分率均增加[11]。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，精子DNA損傷與精索靜脈曲張、支原體[12]、衣原體[13]等病因有關(guān)。日本有研究指出，慢性酗酒是SDF的重要預(yù)測(cè)變量[14]。

2.2.3醫(yī)源因素化療和放療會(huì)顯著誘導(dǎo)精子DNA損傷，降低魚精蛋白水平，從而改變DNA結(jié)構(gòu)；化療結(jié)束24個(gè)月，治療成功的睪丸癌患者仍有高濃度的精子DNA損傷[15]。

3精子DNA損傷的檢測(cè)方法

精子自身沒有修復(fù)機(jī)制，DNA損傷幾乎存在于所有精子中，而臨床上最重要的是損傷程度對(duì)于治療結(jié)果的不利影響，任何有用的診斷或影響預(yù)后的檢測(cè)，必須有一個(gè)閾值對(duì)臨床情況提供足夠的區(qū)分能力，而常規(guī)精液分析不符合這些標(biāo)準(zhǔn)。因此，近年來，用于檢測(cè)精子DNA損傷的彗星試驗(yàn)[16]、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗(yàn)(sperm chromatin structure assay,SCSA)[17]、精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)(sperm chromatin dispersion test,SCD)[18]和TUNEL試驗(yàn)(deoxynucleotidyltransfe rase-mediated dUTP nick end labeling assay)[19]被廣泛開展。每個(gè)試驗(yàn)可能闡明的是DNA損傷的不同方面，因此可以預(yù)料到這些試驗(yàn)分析的結(jié)果并不等價(jià)。此外，DFI似乎已經(jīng)成為所有的DNA測(cè)試的通用術(shù)語，但DFI只適用于SCSA。

3.1彗星試驗(yàn)彗星試驗(yàn)是一種單細(xì)胞凝膠電泳分析，可量化單個(gè)精子斷鏈的DNA，其主要優(yōu)勢(shì)是只需要5000個(gè)精子，因此適用于評(píng)估臨床使用后的小樣本或只有很少精子可用的附睪和睪丸精子樣本。不像其他試驗(yàn)主要檢測(cè)組蛋白關(guān)聯(lián)染色質(zhì)的斷鏈，彗星試驗(yàn)對(duì)于檢測(cè)魚精蛋白或組蛋白關(guān)聯(lián)的染色質(zhì)均能同等地廣泛使用。最近，第一次用彗星試驗(yàn)報(bào)道了妊娠并活產(chǎn)夫婦的SDF顯著低于體外受精(in vitro fertilization，IVF)治療后未活產(chǎn)的夫婦；彗星試驗(yàn)高靈敏度的優(yōu)勢(shì)在于，幾乎一半的以前無法解釋的不孕夫婦，現(xiàn)在能用精子DNA損傷的形式進(jìn)行診斷[20]。

3.2SCSASCSA測(cè)量的是單鏈SDF，只有兩個(gè)簡(jiǎn)單的生化步驟，其技術(shù)要求遠(yuǎn)低于其他試驗(yàn)，但不適合較低的樣本數(shù)量。SCSA的主要優(yōu)勢(shì)是同時(shí)測(cè)量?jī)蓚€(gè)重要的指標(biāo)，即DFI和高DNA可染性。國(guó)際公認(rèn)的自然妊娠和宮腔內(nèi)人工授精(intrauterine insemination，IUI)妊娠DFI閾值為25%；當(dāng)高DNA可染性>35%時(shí)無法成功妊娠[21]。有學(xué)者認(rèn)為，主要檢測(cè)螺線管連接子位點(diǎn)的SCSA比其他方法具有更好的臨床意義[4]。

3.3SCDSCD只測(cè)量松懈的完整DNA和外圍組蛋白，而非受損的精子DNA。SCD是一個(gè)簡(jiǎn)單而廉價(jià)的試驗(yàn)，無需依賴顏色或熒光強(qiáng)度，只需常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的光學(xué)顯微鏡就能分析。3.4TUNEL試驗(yàn)TUNEL試驗(yàn)可檢測(cè)單鏈和雙鏈DNA損傷，可通過流式細(xì)胞儀或顯微鏡進(jìn)行分析評(píng)估，也可靈活運(yùn)用于少量樣本分析和無專用昂貴流式細(xì)胞儀設(shè)施的小實(shí)驗(yàn)室。由于TUNEL試驗(yàn)特定分析磷酸二酯鍵的斷鏈，因此常被用來確定凋亡。許多因素會(huì)影響TUNEL的臨床應(yīng)用，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室間不能比較和解釋臨床閾值。最近，Aitken等[21]改善了TUNEL分析步驟，消除了測(cè)量壞死細(xì)胞(通常是高水平損傷)的誤差，但有效的臨床閾值尚未建立。

以上方法均對(duì)精子有損傷，檢測(cè)后的精子不能用于輔助生殖。2011年，Mallidis等[22]利用拉曼光譜儀采集UVB波段幅照前后精子拉曼光譜的變化，結(jié)合主成分分析和小波分析，提示拉曼光譜可精確評(píng)估精子DNA結(jié)構(gòu)以及損傷部位。2013年，黃祖芳[23]首次實(shí)現(xiàn)了活體精子頭部吸附于光滑金屬基底的操作，并初步開展了活體精子的顯微拉曼光譜測(cè)量，初步證實(shí)1055/1095 cm-1的譜峰比值可作為評(píng)估精子質(zhì)量的閾值。

4精子DNA損傷對(duì)生殖結(jié)局的影響

4.1精子DNA損傷與男性不育研究發(fā)現(xiàn)，精子DNA損傷>20%，自然受孕的概率開始下降，當(dāng)損傷超過40%，自然受孕概率接近于零[3]。雖然精子DNA損傷<20%不能保證男性正常生育，但是DNA的高度損傷會(huì)嚴(yán)重影響男性的生育能力，當(dāng)精子濃度<20×109/L或精子活力、形態(tài)任一項(xiàng)指標(biāo)有損傷時(shí)，DNA損傷閾值降至10%[24]。在另一項(xiàng)研究中，Simon等[25]采用彗星試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，98%的不育男性SDF>25%。因此，有學(xué)者回顧分析了精子DNA損傷與男性不育的相關(guān)檢測(cè)，初步確定了各種試驗(yàn)方法的檢測(cè)閾值，TUNEL、SCSA、SCD、堿性彗星試驗(yàn)和中性彗星試驗(yàn)的檢測(cè)閾值分別為20.05%、18.90%、22.75%、45.37%和34.37%[26]。

4.2精子DNA損傷與自然流產(chǎn)父源DNA構(gòu)成胚胎基因組成分的一半，因此精子的一些異常因素會(huì)影響胚胎發(fā)育，從而引起流產(chǎn)。Imam等[27]用SCSA研究DNA損傷特發(fā)性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的DFI，其均值為23.37±9.9，比正常對(duì)照者(13.89±5.40)顯著增高；Khadem等[28]也發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)男性的DFI更高，精子前向運(yùn)動(dòng)能力更差。采用SCD分析結(jié)果也一致，精子的大暈、小暈和無暈等DNA損傷指標(biāo)均有明顯差異[29]。精子DNA損傷的檢查應(yīng)該推薦給復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者，更為重要的是建立判斷預(yù)后的檢測(cè)閾值。Ribas-Maynou等[30]提出，當(dāng)中性彗星試驗(yàn)SDF>77.5%，根據(jù)卵母細(xì)胞修復(fù)雙鏈DNA損傷的能力，可預(yù)測(cè)流產(chǎn)的可能性，此方法的靈敏度和特異度分別為88.3%和88.0%；同時(shí)提出SCD的閾值為18.5%，但靈敏度低于中性彗星試驗(yàn)。

4.3精子DNA損傷與輔助生殖技術(shù)

4.3.1精子DNA損傷與IUI精子DNA損傷和低生育力之間的關(guān)系在IUI表現(xiàn)明顯。楊曉玉等[31]分析了482例IUI患者，發(fā)現(xiàn)DFI>25%的患者，其生化妊娠率和臨床妊娠率只有DFI≤25%的患者的0.37倍和0.38倍。Bungum等[32]對(duì)131對(duì)夫婦進(jìn)行IUI治療，結(jié)果顯示，DFI≤27%的患者比 DFI>27%的患者懷孕和分娩的機(jī)會(huì)更高，建議所有IUI患者檢測(cè)精子染色質(zhì)完整性，以較好地評(píng)估預(yù)后。Baldi和Muratori[4]總結(jié)后認(rèn)為，彗星試驗(yàn)<25%、SCSA<15%時(shí)才選擇IUI治療。經(jīng)過IUI精子處理程序后，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者也能提高妊娠率。張洲等[33]嘗試對(duì)33例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者進(jìn)行IUI治療共79個(gè)周期，妊娠率為17.7%，高于同期IUI妊娠率(12.4%)，而流產(chǎn)率(7.1%)顯著低于文獻(xiàn)報(bào)道的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的流產(chǎn)率(30%～40%)。

4.3.2精子DNA損傷與體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)/卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)IVF-ET和ICSI技術(shù)使男性不育患者可獲得其生物學(xué)子代的機(jī)會(huì)，但是這些技術(shù)尤其是ICSI技術(shù)使一些DNA損傷精子也會(huì)被注入卵母細(xì)胞內(nèi)。卵母細(xì)胞雖有修復(fù)精子DNA損傷的功能，但這種修復(fù)機(jī)制只有在精子DNA損傷<8%時(shí)才有效，超過這個(gè)水平可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞激活障礙和胚胎發(fā)育受到損害[34]。Simon等[35]分析研究了215對(duì)采用輔助生殖技術(shù)的夫婦，認(rèn)為SDF的增加對(duì)胚胎質(zhì)量會(huì)產(chǎn)生不利影響，包括降低受精率，降低胚胎卵裂率和質(zhì)量，減少發(fā)育成囊胚的胚胎數(shù)量，胚胎停育的數(shù)量增加，并且會(huì)降低著床率和妊娠率，且這種影響從早期胚胎發(fā)育的第2日開始并持續(xù)至胚胎移植之后，從而降低了植入率和妊娠結(jié)局。Zhao等[36]證實(shí)，無論IVF還是ICSI，高精子DNA損傷均會(huì)導(dǎo)致更高的流產(chǎn)率。使用彗星試驗(yàn)的最新研究表明，當(dāng)SDF較低(<25%)時(shí)，IVF治療后有33%的活產(chǎn)率，但當(dāng)SDF>50%時(shí)，IVF的活產(chǎn)率僅為13%[20]。有學(xué)者統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DFI≤17.6%時(shí)，懷孕概率增高3.5倍，DFI每增加10%，不孕概率增加1.31%[34]。若對(duì)ICSI技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，如胞質(zhì)內(nèi)精子形態(tài)學(xué)選擇注射，可減少注射DNA受損的風(fēng)險(xiǎn)，似乎能改善臨床結(jié)局，尤其是對(duì)精子DNA損傷起關(guān)鍵作用的老年婦女的ICSI周期[37]。然而,有數(shù)據(jù)對(duì)初步得到的有利結(jié)果存在質(zhì)疑。在一個(gè)前瞻性臨床研究中，ICSI和IVF患者妊娠后均無SCSA的參數(shù)差異，即使存在高水平的DFI[38]。Niu等[39]也指出，在223對(duì)IVF夫婦中，不同DFI組，除優(yōu)質(zhì)胚胎率外，臨床妊娠率沒有顯著差異。對(duì)1082個(gè)卵裂期凍融胚胎周期和653個(gè)囊胚期凍融胚胎周期研究后發(fā)現(xiàn)，ICSI周期中SDF≤30%組的囊胚形成率明顯增加，但SDF10%、20%、25%、30%、35%、40%組的臨床妊娠率、生化妊娠率和流產(chǎn)率均無明顯變化[40]。

事實(shí)上，不管應(yīng)用哪種技術(shù)，高水平的精子DNA損傷都與妊娠丟失風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān)(OR=2.5,95%CI1.5～4.0)[41]，因此，選擇沒有DNA損傷的精子可以改善輔助生殖技術(shù)的治療結(jié)果，精子DNA損傷閾值的確定對(duì)于臨床更有意義。Baldi和Muratori[4]回顧總結(jié)了前人的研究后認(rèn)為，IVF周期中彗星試驗(yàn)和SCSA的閾值分別為25%～50%和15%～30%；當(dāng)彗星試驗(yàn)或SCSA>50%時(shí)，建議進(jìn)入ICSI周期治療。

4.4精子DNA損傷影響后代健康動(dòng)物研究提供了令人信服的證據(jù)，表明誘導(dǎo)男性生殖細(xì)胞系的DNA損傷可引起流產(chǎn)和后代的發(fā)病率[42]。研究表明，對(duì)后代健康的不良影響是通過DNA損傷的精子遺傳的，癲癇的高發(fā)生率、精神分裂癥、自閉癥和雙相情感障礙等疾病的高發(fā)生率與之相關(guān)，后代癌癥以及先天性畸形的風(fēng)險(xiǎn)增加也與之相關(guān)；父親的年齡與精子DNA損傷的發(fā)生率高相關(guān)，使后代增加突變負(fù)荷[11]。以往IVF和ICSI未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)存在差異，但最近澳大利亞南部的研究分析顯示，ICSI比IVF嬰兒出生缺陷顯著增加[43]，但這種差別在冷凍胚胎中并未發(fā)現(xiàn)。胚胎冷凍相關(guān)的壓力可能會(huì)選擇性消除任何有缺陷的胚胎生成。根據(jù)這些結(jié)果，在父親精子高DNA損傷以及存在明顯的正常胚胎發(fā)育風(fēng)險(xiǎn)的情況下，似乎可選擇ICSI胚胎常規(guī)冷凍。

5小結(jié)

精子DNA損傷的評(píng)估非常重要，應(yīng)作為精液常規(guī)檢查的一部分，并可作為預(yù)測(cè)輔助生殖治療成功的有用指標(biāo)。精子SDF并非靜態(tài)參數(shù)，其與SDF動(dòng)力學(xué)的關(guān)系需要進(jìn)一步探討。由于高精子DNA損傷的IUI成功率非常低，建議患者直接進(jìn)入IVF或ICSI周期。在輔助生殖之前，適當(dāng)口服抗氧化劑組合來改善精子DNA損傷情況應(yīng)該是合適的，在分子水平上建立精子DNA損傷的潛在的抗氧化治療方法是迫切需要解決的問題。

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The Research Progress of Sperm DNA Damage Effect on Reproductive OutcomesTANYan1,2,FANLi-qing1.(1.InstituteofHumanReproductionandStemCellEngineering,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China； 2.DepartmentofReproduction,ZhuzhouCityMaternalandChildHealthCareHospital,Zhuzhou412000,China)

Abstract：The integrity of human sperm chromatin structure is an important factor affecting sperm fertility and child safety,thus is closely related to the reproductive outcomes:and it can cause and predict male infertility and spontaneous abortion;and it can be used to evaluate the prognosis of intrauterine insemination(IUI),and affect the in vitro fertilization-embryo transfer(IVF-ET) and intracytoplasmic sperm injection(ICSI) fertilization rate.implantation rate and pregnancy rate,etc.The increase of sperm DNA damage is associated with abortion increases.Adverse health effects to offspring is through genetic DNA damage of sperm,so the determination of sperm DNA damage threshold is very important for improving outcome of assisted reproduction treatment.

Key words：Sperm； DNA damage； Chromatin； Reproductive outcomes； Threshold

收稿日期：2015-03-10修回日期：2015-05-16編輯：鄭雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.011

中圖分類號(hào)：R698

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)24-4448-04