李瑞妮，榮為為綜述，金世柱，韓明子審校

0 引 言

現(xiàn)在干細(xì)胞移植的研究及治療已成為熱點(diǎn)問題，但是干細(xì)胞移植仍存在許多問題，如干細(xì)胞獲得效率、移植數(shù)量和時(shí)機(jī)、移植的最佳途徑、移植后定位跟蹤及體內(nèi)分化、安全性問題，其中體外擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是所有問題之一［1］。

骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是成體干細(xì)胞的一種，具有多向分化潛能，使利用BMSCs 治療相關(guān)疾病成為可能。但是BMSCs 含量極少，約為骨髓單個(gè)核細(xì)胞的十萬分之一，不利于其研究及應(yīng)用，因此需經(jīng)過體外增殖才能滿足應(yīng)用需求。本文就骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的主要方法及策略進(jìn)行綜述。

1 血清培養(yǎng)法

吳剛等［2］采用Ficoll 密度梯度離心法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別在含臍血清、胎牛血清、及無血清的L-DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，證實(shí)臍血清和胎牛血清均能促進(jìn)細(xì)胞增殖，但BMSCs 在臍血清中增殖更活躍，在無血清L-DMEM 培養(yǎng)液中BMSCs 基本無增殖。BMSCs 增殖需要多種因子協(xié)同作用，而臍血清含有與間充質(zhì)干細(xì)胞增殖有關(guān)的細(xì)胞因子和生長因子，如血小板轉(zhuǎn)化生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子，這些因子形成間充質(zhì)干細(xì)胞所需的天然配比，同時(shí)臍血清取材方便，臨床獲取較為容易，含有免疫原性的物質(zhì)更少、更安全［3］。但是血清培養(yǎng)經(jīng)常被病毒污染，其中存在許多可能對細(xì)胞培養(yǎng)有害且不受操控的未知因素。

2 細(xì)胞培養(yǎng)法

目前，據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記、細(xì)胞形態(tài)、顆粒大小，用于分離培養(yǎng)BMSCs 的方法主要有以下幾種:全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠法。

2.1 全骨髓貼壁培養(yǎng)法 全骨髓貼壁培養(yǎng)法是利用BMSCs 對塑料底的貼附性，定期換液去除懸浮生長的造血系細(xì)胞進(jìn)行分選純化。這種方法省略了BMSCs的分離步驟，從而減少了細(xì)胞的污染和丟失。全骨髓貼壁接種法操作簡便，對細(xì)胞損傷小，應(yīng)用廣泛，是獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最簡便、有效的分離和純化方法［4］。宮宇等［5］采用全骨髓貼壁接種法進(jìn)行體外分離培養(yǎng)SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子的表達(dá)，表明此種方法不需離心，造成污染的環(huán)節(jié)和機(jī)會(huì)較少，可以更好地保持細(xì)胞的活性狀態(tài)，獲得的干細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)均一，胞體飽滿，呈梭形，具有較高的生物活性適合作為種子細(xì)胞。

2.2 密度梯度離心法 密度梯度離心法是BMSCs分離、純化和擴(kuò)增最常用的方法，是根據(jù)BMSCs 與其他細(xì)胞密度不同，利用Percoll 分離液將BMSCs 分離出來，除去多余的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其他細(xì)胞，得到高純度的BMSCs，但是操作繁瑣，耗時(shí)長且容易丟失，并增加了細(xì)胞污染的可能性。有實(shí)驗(yàn)利用密度梯度離心法分離出人骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononuclearcells，MNC)，通過貼壁篩選法建立人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymalstem cell，hBMSC)的體外培養(yǎng)體系，按照此培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)可獲得hBMSC，但在培養(yǎng)過程中細(xì)胞逐漸出現(xiàn)老化現(xiàn)象，且不能凍存［6］。

李英慧等［7］用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化成年大鼠BMSCs，發(fā)現(xiàn)此種方法能有效地分離純化成年大鼠BMSCs，所獲的細(xì)胞形態(tài)均一，增殖速度快，生長性狀穩(wěn)定，且操作簡便，成本低。穆曉紅等［8］采用密度梯度離心法培養(yǎng)兔BMSCs，對細(xì)胞的形態(tài)及生長特性進(jìn)行觀察，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測 細(xì) 胞 表 面 抗 原CD29、CD34、CD44、CD45、CD166、HLA-DR 表達(dá)，并進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)特性鑒定，發(fā)現(xiàn)密度離心法能分離培養(yǎng)出純度較高的BMSCs。流式細(xì)胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD166，不表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR，因此此種方法可以分離得到抗原表型均一、純度較高、生物學(xué)特性穩(wěn)定的BMSCs。

2.3 流式細(xì)胞儀與免疫磁珠分離法 有實(shí)驗(yàn)利用免疫磁珠法分離成人骨髓神經(jīng)生長因子受體(nerve growth factor receptor，NGFR)陽性細(xì)胞，獲得同質(zhì)性BMSCs 并進(jìn)行向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)采用Percoll密度梯度離心法分離成人骨髓中MNCs，對MNCs 進(jìn)行常規(guī)貼壁培養(yǎng)或者應(yīng)用磁珠分離技術(shù)分離NGFR陽性細(xì)胞，證明NGFR 是一個(gè)原始BMSCs 表面標(biāo)志，將其與免疫磁珠分離技術(shù)相結(jié)合，可從骨髓中篩選出NGFR 陽性細(xì)胞，從而獲得具有同質(zhì)功能型和免疫表型的原始BMSCs［9］。免疫磁珠分離獲得NGFR陽性細(xì)胞的純度為(90.6±5.1)%，NGFR 陽性細(xì)胞較貼壁培養(yǎng)獲得BMSCs 具備更強(qiáng)增殖能力和向軟骨分化潛能。利用免疫磁珠分離骨髓NGFR陽性可以獲得同質(zhì)性原始BMSCs。

流式細(xì)胞儀分離法利用BMSCs 體積小和表面抗原的特殊性分離出純度較高的BMSCs。此2 種方法雖可獲得較高純度的干細(xì)胞，但存在成本高、操作繁瑣以及體外操作時(shí)間長等缺點(diǎn)，且對細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重，對細(xì)胞的活性有部分影響，因此未能得到很好的推廣。

3 共培養(yǎng)體系

20 世紀(jì)90 年代中后期，共培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞—細(xì)胞間相互作用的基礎(chǔ)生物學(xué)研宄。共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用在組織和器官的構(gòu)建中起重要作用［10］。

共培養(yǎng)中細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸方式有多種，包括細(xì)胞與細(xì)胞之間的混合單層共培養(yǎng)，細(xì)胞與細(xì)胞間的分層滲透培養(yǎng)等。有研究采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并構(gòu)建單層共培養(yǎng)、細(xì)胞非接觸同時(shí)聯(lián)合生物誘導(dǎo)的方法，聯(lián)合不同誘導(dǎo)機(jī)制使其效應(yīng)增強(qiáng)。細(xì)胞微團(tuán)的三維培養(yǎng)方法既減少細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中其相互接觸的機(jī)會(huì)，又同時(shí)帶來微團(tuán)中心細(xì)胞液化、壞死等情況，但獲取細(xì)胞數(shù)量有限［11］。

有實(shí)驗(yàn)使用關(guān)節(jié)軟骨和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)以考察細(xì)胞和細(xì)胞之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長［12］。張治金等［13］將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于人脫細(xì)胞羊膜上，體外共培養(yǎng)后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)觀察到羊膜與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外共培養(yǎng)提示羊膜的生物相容性良好，并能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長及增殖。

4 細(xì)胞因子的促進(jìn)作用

細(xì)胞因子是一類具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化、遷移和基因表達(dá)等生物效應(yīng)的多肽類物質(zhì)，對細(xì)胞增殖、組織或器官的修復(fù)、再生具有重要的促進(jìn)作用。常見的細(xì)胞因子包括生長因子，如表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、干細(xì)胞生長因子及集落刺激因子等。

4.1 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF) bFGF 是一種內(nèi)源性多肽生長因子，主要分布于富含血管的組織中，如大腦、垂體、視網(wǎng)膜等。bFGF 具有多重生物學(xué)效應(yīng)，是調(diào)控BMSCs 增殖和定向分化的首選生長因子之一。有實(shí)驗(yàn)研究表明培養(yǎng)基中加入bFGF 可減緩BMSCs增殖速度的下降趨勢，細(xì)胞培養(yǎng)的第4 ～6 天后，細(xì)胞仍呈上升趨勢，表明bFGF 可促進(jìn)BMSCs 增殖，更好地維持BMSCs 的生長狀態(tài)［14］。

4.2 粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF) G-CSF 是由單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種造血生長因子，它是一種促粒細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，其生物效應(yīng)通過與效應(yīng)細(xì)胞表面特異性受體(G-CSF 受體)結(jié)合而產(chǎn)生。由于BMSCs 也有G-CSF 受體，這就為G-CSF 提供了作用靶點(diǎn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，G-CSF 可增加骨髓中具有BMSCs 特性的成纖維樣細(xì)胞集落(colonyforming units-fibroblast，CFU-F)的含量，預(yù)示G-CSF 具有促進(jìn)BMSCs 活性的潛力［15］。李洪等［16］采用差速貼壁法分離細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定。按不同濃度給 予G-CSF，分 為4 組(G0～3組)，G0組 不 含G-CSF，設(shè)為陰性對照，G1～3組分別含G-CSF 5、10、20 ng/mL，按1×105/mL 密度接種于平底96 孔培養(yǎng)板中(每孔100 μL)。MTT 法測定各組加入G-CSF第1、3、5、7 天吸光度(A 值)的變化，觀察G-CSF 對BMSCs 增殖的影響，結(jié)果表明G-CSF 具有促進(jìn)BMSCs增殖的作用。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)G-CSF 有促進(jìn)BMSCs增殖的作用［17］。

5 生物反應(yīng)器

在干細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，傳統(tǒng)靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)方法擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞既費(fèi)時(shí)又易被污染，隨著間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床應(yīng)用的增加，急需一種能快速擴(kuò)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。生物反應(yīng)器是整個(gè)過程的關(guān)鍵設(shè)備，它為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境并決定著細(xì)胞的質(zhì)量和產(chǎn)量。生物反應(yīng)器包括以下幾種類型:攪拌式生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、膜生物反應(yīng)器等。

有實(shí)驗(yàn)采用生物反應(yīng)器擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，不但能夠使BMSCs 在數(shù)量上得到擴(kuò)增，而且能夠使擴(kuò)增后的BMSCs 在質(zhì)量上有所保證，對于解決臨床應(yīng)用上所面臨的BMSCs 來源受限、數(shù)量不足及質(zhì)量不高的難題無疑具有重大意義［18］。實(shí)驗(yàn)利用微載體懸浮培養(yǎng)體系在攪拌式生物反應(yīng)器內(nèi)擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，和靜態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方式比較發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)器內(nèi)的BMSCs 能夠在cytodex-3 表面更好的黏附、貼壁并保持活躍的生長狀態(tài)，當(dāng)BMSCs于第5 天達(dá)到增殖高峰時(shí)，平均可擴(kuò)增10.55 倍，明顯優(yōu)于對照組的6.10 倍(P ＜0.05)［19］。

6 誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS)

日本科學(xué)家Yamanaka 等［20］發(fā)現(xiàn)用4 種轉(zhuǎn)錄因子(Oct4，Sox2，Klf4 和c-Myc)可以在體外直接誘導(dǎo)小鼠皮膚成纖維體細(xì)胞成為具有像胚胎干細(xì)胞樣的具有多發(fā)育潛能的多能干細(xì)胞，這種細(xì)胞被稱為iPS。最新研究表明，iPS 具有和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)類似且優(yōu)于ESCs 的特性，又不存在ESCs 所面臨的倫理和免疫排斥問題［21］。Darabi 等［22］在人ESCs 和iPS 細(xì)胞中條件性表達(dá)PAX7，獲得了大量的肌源性干細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞移植到患有肌營養(yǎng)不良的小鼠骨骼肌內(nèi)。他們在移植后的小鼠體內(nèi)檢測到人源的高強(qiáng)度肌纖維，并且可以持續(xù)存在11 個(gè)月。Rashid 等［23］利用遺傳性肝臟疾病患者身上的皮膚細(xì)胞重編程為iPS，然后培育成肝細(xì)胞，可用于試驗(yàn)各種藥物，對于制備疾病的新模型和藥物的研發(fā)等具有重要意義。

由于現(xiàn)在獲得的iPS 細(xì)胞大多是通過病毒介導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子建立起來的，這樣的iPS 細(xì)胞基因組DNA 中有隨機(jī)插入的病毒DNA，存在產(chǎn)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，因此無法應(yīng)用到患者身上［24］。

7 中 藥

中藥有兩千多年的歷史，資源豐富，具有滋陰補(bǔ)陽、抗衰老和調(diào)節(jié)免疫功能、毒副作用小、療效好等特點(diǎn)，可能含有大量能促進(jìn)BMSCs 增殖、分化的成分，因此被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)BMSCs 增殖研究中。如黃芪不僅能夠促進(jìn)BMSCs 的增殖，還能抑制其凋亡［25］。黃鳳等［26］采用采集空白對照大鼠、益氣藥、活血藥、益氣活血藥灌胃大鼠含藥血清，用10%濃度以上不同含藥血清培養(yǎng)第3 代BMSCs，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。用流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs，結(jié)果表明益氣活血中藥含藥血清對培養(yǎng)BMSCs 增殖有促進(jìn)作用。人參皂苷不僅能夠促進(jìn)BMSCs 的增殖，還能誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞以及心肌樣細(xì)胞分化。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明人參皂苷可促進(jìn)BMSCs 增殖［27］。

8 結(jié) 語

BMSCs 作為再生醫(yī)學(xué)中的種子細(xì)胞，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域乃至整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，要想使其應(yīng)用于臨床，進(jìn)行大量擴(kuò)增是需要解決的關(guān)鍵問題。上述幾種促進(jìn)BMSCs 增殖的方法，雖然在BMSCs 的擴(kuò)增方面起到了關(guān)鍵性作用，但是每種方法都存在或多或少的缺陷，需要更加深入地進(jìn)行探究。目前，利用上述方法對BMSCs 進(jìn)行大量擴(kuò)增仍存在一定的局限性，暫時(shí)還無法進(jìn)行推廣應(yīng)用。因此，尋求一種更為簡便、經(jīng)濟(jì)、安全、有效的擴(kuò)增BMSCs的方法顯得尤為重要。

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