王歡，孫發(fā)，邢俊平，丁上書，孫超，王新陽，鄒鐵軍，唐開發(fā)，

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)電鏡室，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽 550004；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，西安 710061；4.陜西省人民醫(yī)院泌尿外科，西安 710068）

谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育精子DNA完整性相關(guān)性的研究

王歡1，孫發(fā)2，邢俊平3，丁上書3，孫超2，王新陽3，鄒鐵軍4，唐開發(fā)2，3

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)電鏡室，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽 550004；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，西安 710061；4.陜西省人民醫(yī)院泌尿外科，西安 710068）

目的探討谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因M1、T1及P1（GSTM1、GSTT1及GSTP1）基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥患者精子DNA斷裂指數(shù)（DFI）的相關(guān)性。方法選擇特發(fā)性少弱精子性男性不育癥患者246例。采用聚合酶鏈反應(yīng)及聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法，分別對(duì)GSTM1、GSTT1及GSTP1基因進(jìn)行分型。采用吖啶橙染色標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子DNA完整性，并計(jì)算DFI。結(jié)果GSTT1基因缺失型組特發(fā)性少弱精子性男性不育癥患者精子DFI顯著高于野生型組（P＜0.01）；而GSTM1基因缺失型組與GSTP1基因突變型組患者精子DFI與野生型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論GSTT1基因缺失型與特發(fā)性男性不育癥精子DFI呈正相關(guān)。

男性不育癥；谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶；基因多態(tài)性；DNA斷裂指數(shù)

男性不育癥是指夫婦同居1年以上，未采取任何避孕措施，由于男性方面的原因?qū)е屡讲荒苁茉姓撸?］。男性不育癥患者中有30%的患者未發(fā)現(xiàn)明確的致病原因，發(fā)病機(jī)制及病理生理過程均不清楚，故稱之為特發(fā)性男性不育癥［2］。研究表明，精子DNA完整性比常規(guī)的精液分析能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)男性的生育能力，且不育癥男性中精子DNA損傷程度明顯高于正常生育的男性，精子DNA損傷可能是男性不育癥的負(fù)相關(guān)因素［3，4］。然而，精子DNA損傷的機(jī)制到目前尚不清楚。研究認(rèn)為，環(huán)境因素（如活性氧）、遺傳因素及凋亡是導(dǎo)致精子DNA損傷的主要因素［5］。

谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferases，GSTs）是一組具有解毒功能的蛋白超基因家族，屬于機(jī)體Ⅱ相解毒酶系統(tǒng)，其中編碼Mu、Theta和Pi亞型酶的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因在人群中存在功能性基因遺傳多態(tài)性［6］。本研究擬探討GSTM1、GSTT1和GSTP1基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥患者精子DNA完整性的相關(guān)性，旨在為男性不育癥的發(fā)病機(jī)制及病理生理過程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象：按WHO第4版標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)進(jìn)行精液分析≥2次，結(jié)果符合以下標(biāo)準(zhǔn)者納入研究：睪丸體積在中國(guó)成人睪丸正常體積范圍內(nèi)（15～25 mL）；精液量≥2.0 mL，精子密度＞5×106/mL～＜20×106/mL，A級(jí)精子百分率＜25%，且（A+B）級(jí)精子百分率＜50%；血清性激素水平在正常范圍內(nèi)；有規(guī)律性生活1年以上，未采取任何避孕措施而女方未受孕。排除標(biāo)準(zhǔn)：性生活異常及具有可能影響精液分析參數(shù)的因素。通過以上納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，共有246例患者納入研究。

1.1.2 主要試劑及儀器：全血基因組提取試劑盒（美國(guó)Axygen biosciences公司），2×PCR Mixture（立陶宛MBI公司）；Biomltra梯度PCR儀（德國(guó)Sigma公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和合成：根據(jù)基因序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物GSTM1：Forward 5′-GAACTCCCTGAAAAG CTAAAGC-3′，Reverse 5′-GTTGGGCTCAAATATAC GGTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度219 bp；GSTT1：Forward 5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′，Reverse 5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度480 bp；GSTP1：Forward 5′-ACCCCAGGGCTCTATG GGAA-3′，Reverse 5′-TGAGGGCACAAGAAGCCC CT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度177 bp；內(nèi)參照β-actin引物序列為：Forward 5′-ACTCCCCATCCCAAGACC-3′，Reverse 5′-CCTTAATGTCACGCACGAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為400 bp［8］。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.2 外周血標(biāo)本采集和基因組DNA提?。翰扇』颊咄庵莒o脈血3 mL，以乙二胺四乙酸二鈉作為抗凝劑混勻?yàn)榭鼓?，置?80℃冰箱備用?；蚪MDNA提取按照外周血微量基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，所提取DNA置于-20℃冰箱備用。

1.2.3 精液標(biāo)本的收集及處理：所有研究對(duì)象禁欲3～5 d，用手淫、取精儀或體外排精法收集一次排精的全部精液，留于清潔收集器皿內(nèi)，標(biāo)明具體采集時(shí)間，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，待液化后備用。

1.2.4 GSTs基因型PCR擴(kuò)增：采用Biomltra梯度PCR儀對(duì)所有DNA標(biāo)本進(jìn)行GSTM1、GSTT1和GSTP1基因型檢測(cè)。反應(yīng)體系為25 μL（2×PCR Mixture 12.5 μL，雙蒸水8.5 μL，1.0 μmol/L引物各0.5 μL，100 μg/μL DNA模板2 μL）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。所有樣本均重復(fù)3次PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)。GSTP1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用BsmAI（ALW26I）限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理。

1.2.5 精子DNA斷裂指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）檢測(cè)：精液標(biāo)本完全液化后，于冰上用TNE緩沖液（0.15 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris-HCl，0.001 mol/L Na2EDTA，pH7.4，4℃），懸浮精子至（1～2）×106/ mL；對(duì)稀釋好的精液標(biāo)本進(jìn)行酸性裂解（0.08 mol/L HCl，0.15 mol/L NaCl，0.1%Triton-X 100，pH1.2，4℃）；加入吖啶橙染液（6 μg/mL吖啶橙，0.037 mol/L檸 檬 酸 ，0.126 mol/L Na2HPO4，0.001 1 mol/L Na2EDTA，0.15 mol/L NaCl，pH6.0，4℃）；收集細(xì)胞并重新懸浮細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測(cè)，488 nm激發(fā)光，單鏈DNA為紅色，雙鏈DNA為綠色。精子DFI= red/（red+green）×100%。重復(fù)檢測(cè)DFI 3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

精子吖啶橙染色熒光顯微鏡下所見及精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見圖1、2。

2.2 GSTM1、GSTT1和GSTP1基因型鑒定

GSTM1基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為219 bp，GSTT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物為480 bp，GSTP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物為177 bp，經(jīng)BsmAI（ALW26I）限制性內(nèi)切酶酶切后，野生型產(chǎn)物為177 bp，突變純合型后產(chǎn)物為87 bp及90 bp，突變雜合型產(chǎn)物為177 bp、87 bp及90 bp，β-actin內(nèi)參照擴(kuò)增產(chǎn)物為400 bp。見圖3、4。

2.3 GSTs基因多態(tài)性與精子DFI的相關(guān)性

圖1 精子吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察 ×40Fig.1 The sperms stained by acridine orange was observed under fluorescence microscopy×40

圖2 精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)Fig.2 Sperm chromatin structure assay detected by flow cytometry

圖3 GSTM1、GSTT1和GSTP1基因遺傳多態(tài)性水平凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis for glutathione S-transferase M1 and T1 gene polymorphism

圖4 GSTP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物BsmAI酶切后水平凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis for GSTP1 gene amplification products digestion by BsmAI enzyme

結(jié)果顯示：GSTM1（-）基因型亞組患者精子DFI與GSTM1（+）基因型亞組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.063）；GSTT1（-）基因型亞組精子DFI明顯高于GSTT1（+）基因型亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；GSTM1/T1（-/-）基因型亞組精子DFI顯著高于GSTM1/T1（+/+）基因型亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；GSTP1（A/G+G/G）基因型亞組精子DFI與GSTP1（A/A）基因型亞組相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.347）。見表1。

3 討論

精液質(zhì)量是評(píng)價(jià)男性生殖能力的基礎(chǔ)，為男性不育的診斷、治療及預(yù)后提供了重要的輔助信息。臨床上常常采用精液分析（包括pH值，精子密度、活力及形態(tài)）來評(píng)估男性的生殖能力［9］。然而，約15%的男性不育癥患者精液分析結(jié)果在正常范圍內(nèi)，因此，對(duì)男性不育癥患者精子質(zhì)量的評(píng)估往往不能僅依據(jù)精液分析［10］。研究發(fā)現(xiàn)，男性不育癥患者精子DNA損傷明顯高于生育的男性，高水平的精子DNA損傷，如精子數(shù)量、活力降低，正常形態(tài)精子減少，往往與較差的精液分析參數(shù)相關(guān)。精子DNA損傷也影響卵細(xì)胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)的成效［3，11］。因此，精子DNA損傷可能是導(dǎo)致男性不育的重要危險(xiǎn)因素之一。

目前，導(dǎo)致精子DNA損傷的原因尚不清楚。研究認(rèn)為，人類精子染色體在其組蛋白被魚精蛋白代替的過程中經(jīng)歷了1次重要的重構(gòu)，需要染色體組蛋白的乙?；约癉NA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，通過解旋DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)形成1個(gè)臨時(shí)的環(huán)，如果這些環(huán)沒有被修復(fù)，即形成了DNA碎片［12～14］。研究表明，精子DNA損傷與高水平的活性氧（reactive oxygen species，ROS）存在密切關(guān)系［15］。體內(nèi)低水平ROS在精子成熟及功能（如精子獲能和頂體反應(yīng)）中扮演著重要的角色。同時(shí)，精漿中的抗氧化物質(zhì)可以保護(hù)精子DNA免受氧化損傷，而過多的ROS則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA損傷［16，17］。

GSTs是一組具有解毒功能的蛋白超基因家族，屬于機(jī)體Ⅱ相解毒酶系統(tǒng)，參與細(xì)胞對(duì)外源性化學(xué)物質(zhì)、人工合成有機(jī)物質(zhì)、ROS及其代謝產(chǎn)物解毒的各個(gè)生理階段［7］。前期研究發(fā)現(xiàn)GSTM1、T1基因缺失型精索靜脈曲張患者精子DNA完整性顯著低于其野生型［7］。本研究采用吖啶橙染色及流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)特發(fā)性男性不育癥患者精子DFI進(jìn)行檢測(cè)分析，同時(shí)對(duì)其GSTs基因多態(tài)性進(jìn)行分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSTT1基因缺失型組精子DFI顯著高于野生型組，而GSTM1、P1基因多態(tài)性未發(fā)現(xiàn)與精子DFI存在相關(guān)性。本研究結(jié)果仍有待于多中心、大樣本進(jìn)一步研究。

表1 特發(fā)性男性不育癥患者各GSTs基因型亞組精子DFI的比較Tab.1 Comparison of sperm DFI in each GSTs genotype of the patients with idiopathic male infertility

［1］World Health Organization.WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile couple［M］.Cambridge：Cambridge University Press，2000.

［2］Pasqualotto FF，Pasqualotto EB，Sobreiro BP，et al.Clinical diagnosis in men undergoing infertility investigation in a university hospital［J］.Urol Int，2006，76（2）：122-125.

［3］Evgeni E，Charalabopoulos K，Asimakopoulos B.Human sperm DNA fragmentation and its correlation with conventional semen parameters［J］.J Reprod Infertil，2014，15（1）：2-14.

［4］Lewis SE，John AR，Conner SJ，et al.The impact of sperm DNA damage in assisted conception and beyond：recent advances in diagnosis and treatment［J］.Reprod Biomed Online，2013，27（4）：325-337.

［5］Komiya A，Kato T，Kawauchi Y，et al.Clinical factors associated with sperm DNA fragmentation in male patients with infertility［J］. Scientific World Journal，2014；2014：868303.

［6］Jiang S，Yu L，Cheng J，et al.Genomic damages in peripheral blood lymphocytes and association with polymorphisms of three glutathione S-transferases in workers exposed to formaldehyde［J］.Mutat Res，2010，695（12）：9-15.

［7］Tang K，Xue W，Xing Y，et al.Genetic polymorphisms of glutathione s-transferase M1，T1，and P1，and the assessment of oxidative damage in infertile men with varicoceles from northwestern china［J］.J Androl，2012，33（2）：257-263.

［8］World Health Organization.WHO laboratory manual for the examination of human Bsmen and sperm-cervical mucus interaction［M］. 4th ed.Cambridge：Cambridge University Press，1999.

［9］Agarwal A，Allamaneni SS.Sperm DNA damage assessment：a test whose time has come［J］.Fertil Steril，2005，84（4）：850-853.

［10］Fraczek M，Szumala-Kakol A，Dworacki G，et al.In vitro reconstruction of inflammatory reaction in human semen：effect on sperm DNA fragmentation［J］.J Reprod Immunol，2013，100（1）：76-85.

［11］Pankotai T，Bonhomme C，Chen D，et al.DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase Ⅱ transcription in the presence of DNA breaks［J］.Nat Struct Mol Biol，2012，19（3）：276-282.

［12］Lagerwerf S，Vrouwe MG，Overmeer RM，et al.DNA damage response and transcription［J］.DNA Repair（Amst），2011，10（7）：743-750.

［13］Nabi A，Khalili MA，Halvaei I，et al.Prolonged incubation of processed human spermatozoa will increase DNA fragmentation［J］. Andrologia，2014，46（4）：374-379.

［14］De Iuliis GN，Thomson LK，Mitchell LA，et al.DNA damage in human spermatozoa is highly correlated with the efficiency of chromatin remodeling and the formation of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，a marker of oxidative stress［J］.Biol Reprod，2009，81（3）：517-524.

［15］Guz J，Gackowski D，F(xiàn)oksinski M，et al.Comparison of oxidative stress/DNA damage in semen and blood of fertile and infertile men［J］.PLoS One，2013，8（7）：e68490.

［16］Aitken RJ，Smith TB，Jobling MS，et al.Oxidative stress and male reproductive health［J］.Asian J Androl，2014，16（1）：31-38.

［17］Hayes JD，F(xiàn)lanagan JU，Jowsey IR.Glutathione transferases［J］. Annu Rev Pharmacol Toxicol，2005，45（1）：51-88.

（編輯 王又冬）

Correlation between Glutathione S-transferase Polymorphisms and Sperm DNA Integrity in Male Patients with Idiopathic Infertile

WANG Huan1，SUN Fa2，XING Jun-ping3，DING Shang-shu3，SUN Chao2，WANG Xin-yang3，ZOU Tie-jun4，TANG Kai-fa2，3

（1.Electron Microscope Lab of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；2.Department of Urology，The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.Department of Urology，The First Affiliated Hospital of Medical College of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China；4.Department ofUrology，ShanxiPeople′s Hospital，Xi′an 710068，China）

ObjectiveTo investigate the correlation between glutathione S-transferase gene M1，T1 and P1（GSTM1，GSTT1and GSTP1）polymorphism and sperm DNA fragmentation index（DFI）in male patients with idiopathic infertile.MethodsThe study included 246 male patients with idiopathic infertility.Polymerase chain reaction（PCR）and polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）were used to identify the genotype of GSTM1，GSTT1and GSTP1，respectively.Sperm DFI was analyzed by flow cytometry with acridine orange staining.ResultsThe sperm DFI was significantly higher in GSTT1 gene null type group than in GSTT1gene wild type group（P＜0.01）；and there were no significant differences in GSTM1and GSTP1gene mutation type groups when comparing with the wild type group（P＞0.05）.ConclusionGSTT1gene deletion was positive associated with the sperm DFI in male idiopathic infertile patients.

male infertility；glutathione S-transferase；polymorphism；DNA fragmentation index

R698+.2

A

0258-4646（2015）12-1075-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81300541）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金計(jì)劃項(xiàng)目{黔科合J字［2012］2054號(hào)}；貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院博士基金（C-2012-6）

王歡（1977-），男，講師，碩士.

唐開發(fā)，E-mail：doc.tangkf@hotmail.com

2014-12-01

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：