鄭華川，申道福，楊雪峰，時(shí)帥，高陽(yáng)，趙爽，張文陸

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤中心，遼寧省腦與脊髓損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，遼寧 錦州 121001）

Beclin 1表達(dá)在胃癌發(fā)生和演進(jìn)中的臨床病理意義及作用機(jī)制

鄭華川，申道福，楊雪峰，時(shí)帥，高陽(yáng)，趙爽，張文陸

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤中心，遼寧省腦與脊髓損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，遼寧 錦州 121001）

目的闡明胃癌發(fā)生和演進(jìn)過(guò)程中Beclin 1表達(dá)的臨床病理意義和分子作用機(jī)制。方法胃癌細(xì)胞MKN28轉(zhuǎn)染Beclin 1表達(dá)質(zhì)粒，利用CCK-8試劑盒和碘化丙啶染色檢測(cè)細(xì)胞增殖和周期。利用原位雜交和免疫組化檢測(cè)組織芯片上胃癌、癌旁黏膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中Beclin 1mRNA和蛋白的表達(dá)，比較其與胃癌發(fā)生、臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果Beclin 1過(guò)表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞MKN28增殖并導(dǎo)致細(xì)胞周期G2期阻滯，胃癌中Beclin 1mRNA表達(dá)高于癌旁黏膜（P＜0.05），Beclin 1蛋白表達(dá)與胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Beclin 1表達(dá)病例多見(jiàn)于老年男性（P＜0.05），彌漫型胃癌中Beclin 1表達(dá)低于腸型和混合型（P＜0.05）。Kaplan-Meier分析顯示，Beclin 1表達(dá)與胃癌良好預(yù)后呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論Beclin 1表達(dá)與胃癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和分化關(guān)系密切，可以作為胃癌患者的預(yù)后因素和基因治療的靶標(biāo)。

胃癌；Beclin 1；疾病發(fā)生；演進(jìn)；預(yù)后

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年發(fā)病率有所下降，但仍然嚴(yán)重威脅人類健康。分子遺傳學(xué)研究證明胃癌是異型性極高的惡性腫瘤，胃癌發(fā)生和發(fā)展是多階段、多基因和多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，這些基因主要包括癌基因、抑癌基因及DNA錯(cuò)配修復(fù)基因等［1］。抑癌基因Beclin 1編碼蛋白含有Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域3（BH3）、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域，可以與Vps34、UVRAG、Ambra1和抗凋亡蛋白形成復(fù)合體，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬發(fā)生且抑制凋亡［2］。Beclin 1等位基因缺失可引發(fā)胚胎致死，其雜合性可提高自發(fā)腫瘤發(fā)生率（如淋巴瘤、肝癌和肺癌），Beclin 1缺失細(xì)胞自噬水平降低、增殖水平升高，提示Beclin 1在抑制腫瘤發(fā)生方面具有重要作用［3］。本研究擬分析Beclin 1過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，觀察胃癌發(fā)生和演進(jìn)中Beclin 1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，比較其表達(dá)與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為胃癌惡性生物學(xué)行為預(yù)警和基因治療提供分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

于日本神奈川縣立癌中心附屬醫(yī)院收集胃癌（n=613）、鄰近正常黏膜（n=518，距癌≥4 cm）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶（n=190）石蠟標(biāo)本，其中女性186例，男性427例，年齡24～87歲，平均年齡62.1歲。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者265例，伴有肝轉(zhuǎn)移的患者35例。標(biāo)本獲得符合神奈川縣立癌中心和遼寧醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)要求，通過(guò)電話和病例查詢獲取胃癌患者的生存信息。臨床病理分期和組織分化分別依據(jù)UICC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)以及Lauren分型。部分侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織Lauren分型和TNM臨床分期信息缺失。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

胃癌細(xì)胞MKN28購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)，于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞利用QIAGEN試劑盒轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin 1表達(dá)質(zhì)?；蛘遬cDNA3.1載體后G418處理并篩選單克隆。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。于96孔板中每孔鋪2.0×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后在不同時(shí)間點(diǎn)加入10 μL CCK-8溶液并培養(yǎng)3 h，最后于450 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè)

胰酶消化細(xì)胞，PBS漂洗，之后在10 mL冰乙醇中固定2 h以上，再經(jīng)PBS漂洗后1 mL RNase（0.25 mg/mL）于37℃孵箱中消化60 min，待細(xì)胞沉淀后向混懸液中加入碘化丙啶（propidium iodide，PI），使其終濃度為50 μg/mL，4℃下避光孵育30 min，最后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 定量RT-PCR

利用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，AMV酶反轉(zhuǎn)2 μg總RNA成cDNA，Beclin 1（F：5′-GATGGAAGG GTCTAAGACGTCCAA-3′，R：5′-TTTCGCCTGGGCT GTGGTAAG-3′）和內(nèi)參GAPDH（F：5′-CAATGAC CCCTTCATTGACC-3′，R：5′-TGGAAGATGGTGAT GGG ATT-3′）引物依據(jù)GenBank序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，定量PCR操作依據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本TaKaRa公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 Western blot

胃癌細(xì)胞在RIPA裂解液中超聲破碎，蛋白定量后變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印，使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，之后膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后用Beclin 1或者β-actin（美國(guó)Santa Cruz公司）一抗孵育60 min，室溫下用IgG-HRP二抗孵育60 min，孵育后均用TBST漂洗3次，每次5 min，最后ECL-Plus檢測(cè)試劑顯色并在LAS4010中獲取信號(hào)。

1.7 組織芯片制備

在HE指導(dǎo)下選取代表性組織結(jié)構(gòu)部位，規(guī)格為2 mm的48陣列組織芯片利用組織芯片機(jī)（KIN-1，日本AZUMAYA公司）構(gòu)建獲得，4 μm厚度切片備用。

1.8 原位雜交

以MKN28細(xì)胞cDNA為模板，利用PCR方法，采用地高辛－dUTP標(biāo)記Beclin 1探針。組織切片經(jīng)過(guò)脫蠟至水，20 μg/mL蛋白酶消化30 min，預(yù)雜交后42℃探針?lè)跤^(guò)夜，切片經(jīng)TBST漂洗后加上抗地高辛的堿性磷酸酶抗體孵育1 h，切片堿化后NBT/ BCIP顯色，甲基綠復(fù)染。Beclin 1 mRNA定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖2）。隨機(jī)選取5個(gè)視野并計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按如下標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：陰性（-），0%～5%；弱陽(yáng)性（+），＞5%～25%；中度陽(yáng)性（++），＞25%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性（+++），＞50%。

1.9 免疫組化

切片脫蠟至水，并將其放置于TRS抗原修復(fù)液中微波爐加熱修復(fù)15 min，之后用10%雙氧水封閉內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶，牛血清白蛋白第Ⅴ組份封閉非特異性著色?？雇肂eclin 1抗體（美國(guó)Sigma公司，1∶50）和抗兔HRP二抗分別孵育15 min，所有反應(yīng)都在間歇照射微波爐中進(jìn)行［1］，每次孵育后TBST漂洗，最后DAB顯色，Mayer’s蘇木素復(fù)染，脫水透明封片。去除一抗作為陰性對(duì)照。Beclin 1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。隨機(jī)選取5個(gè)視野并計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按如下標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：陰性（-），0%～5%；弱陽(yáng)性（+），＞5%～25%；中度陽(yáng)性（++），＞25%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性（+++），＞50%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)比較組間平均值，Spearman相關(guān)分析等級(jí)資料，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank分析確定生存率差別。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin 1過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞惡性增殖和細(xì)胞周期的影響

RT-PCR和Western blot結(jié)果提示，Beclin 1質(zhì)粒在MKN28細(xì)胞中成功表達(dá)，Beclin 1mRNA和蛋白均表達(dá)增高（圖1A），陰性和空白對(duì)照組細(xì)胞增殖速度要快于Beclin 1轉(zhuǎn)染體（圖1B），PI染色結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Beclin 1的胃癌細(xì)胞出現(xiàn)了G2期阻滯（圖1C、1D）。

圖1 Beclin 1過(guò)表達(dá)影響胃癌細(xì)胞的增殖Fig.1 Influence of Beclin 1 overexpression on the proliferation of gastric cancer cells

2.2 胃癌發(fā)生中Beclin 1mRNA和蛋白表達(dá)

如圖2所示，Beclin 1mRNA信號(hào)主要定位于黏膜上皮腺體和胃癌細(xì)胞胞質(zhì)中。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，原發(fā)癌（81.6%，31/38）中Beclin 1mRNA表達(dá)高于癌旁黏膜（64.6%，31/48）（P＜0.05），而原發(fā)癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶（93.3%，28/30）中Beclin 1mRNA表達(dá)未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。Beclin 1蛋白定位于淺表腸化生黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞胞質(zhì)中，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明癌旁黏膜（60.1%，352/586）、原發(fā)癌（56.6%，320/565）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶（52.7%，88/167）中Beclin 1蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 Beclin 1表達(dá)與胃癌病理特征和預(yù)后的關(guān)系

如表3所示，Beclin 1蛋白表達(dá)與胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與患者腫瘤侵襲深度、淋巴和靜脈侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05），Beclin 1表達(dá)多見(jiàn)于老年男性（P＜0.05），彌漫型胃癌中Beclin 1表達(dá)低于腸型和混合型（P＜0.05）。隨訪504例胃癌患者，中位生存時(shí)間68.5個(gè)月，Kaplan-Meier分析顯示Beclin 1表達(dá)與胃癌患者良好預(yù)后呈正相關(guān)（P＜0.05，圖3）。

3 討論

Beclin 1是自噬小泡必需的自噬蛋白，能夠參與細(xì)胞正常生理生長(zhǎng)，阻礙細(xì)胞周期演進(jìn)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［2，3］。與結(jié)直腸癌的結(jié)果一致［4］，胃癌中Beclin 1 mRNA表達(dá)上調(diào)，提示Beclin 1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)參與胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，該過(guò)程可能為了抑制胃癌惡性行為的反應(yīng)性升高。此外，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌和黏膜中Beclin 1蛋白表達(dá)水平接近，Beclin 1 mRNA化學(xué)穩(wěn)定性、翻譯和翻譯后降解可為此提供科學(xué)的解釋。胃癌組織中Beclin 1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率僅為50%，靶向敲除Beclin 1可以作為制備自發(fā)胃腫瘤模型的策略（工作正在進(jìn)行中），而且監(jiān)控Beclin 1表達(dá)可以作為其靶向治療適應(yīng)證篩選的方法。

圖2 胃癌和癌旁黏膜組織中Beclin 1 mRNA和蛋白表達(dá)Fig.2 The mRNA and protein expression of Beclin 1in gastric cancer and mucosa

表1 胃癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中Beclin 1mRNA表達(dá)Tab.1 Beclin 1mRNA expression in gastric carcinogenesis and subsequent development

表2 Beclin 1蛋白在胃癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)Tab.2 Beclin 1 protein expression in gastric carcinogenesis and subsequent development

圖3 Beclin 1蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.3 Correlation between Beclin 1 status and prognosis of the gastric cancer patients

本研究發(fā)現(xiàn)，Beclin 1表達(dá)與胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示胃癌中抑癌基因Beclin 1表達(dá)可能發(fā)揮轉(zhuǎn)移抑制作用。研究表明，Beclin 1低表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［5］、非小細(xì)胞肺癌腫塊大?。?］以及胰腺導(dǎo)管腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［7］顯著相關(guān)。有文獻(xiàn)［4，8］報(bào)道，結(jié)直腸癌中Beclin 1表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，Beclin 1過(guò)表達(dá)減慢了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并使細(xì)胞周期在G1期阻滯，與本研究結(jié)果相一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)彌漫型胃癌中Beclin 1表達(dá)低于腸型胃癌，說(shuō)明Beclin 1差異表達(dá)是胃癌分化的分子基礎(chǔ)。在此，我們也發(fā)現(xiàn)Beclin 1表達(dá)水平與胃癌良好預(yù)后呈正相關(guān)，與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌［6］、胰腺導(dǎo)管腺癌［7］、ⅢB結(jié)腸癌［9］和鼻型結(jié)外自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤［10］的報(bào)道一致，提示Beclin 1對(duì)于反映胃癌患者良好預(yù)后來(lái)說(shuō)是一個(gè)很好的分子標(biāo)志。

本課題組一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Beclin 1表達(dá)參與胃癌發(fā)生過(guò)程，其表達(dá)下調(diào)與胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、去分化和不良預(yù)后關(guān)系密切，可以作為預(yù)警胃癌發(fā)生和預(yù)后的分子標(biāo)志，因其可抑制增殖和細(xì)胞周期演進(jìn)，所以可作為胃癌基因治療的靶標(biāo)。

［1］Zheng HC，Li XH，Hara T，et al.Mixed-type gastric carcinomas exhibit more aggressive features and indicate the histogenesis of carcinomas［J］.Virchows Arch，2008，452（5）：525-534.

表3 胃癌中Beclin 1蛋白表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between Beclin 1 protein expression of gastric cancer and its clinicopathological features

［2］Kang R，Zeh HJ，Lotze MT，et al.The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis［J］.Cell Death Differ，2011，18（4）：571-580.

［3］Qu X，Yu J，Bhagat G，et al.Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the Beclin 1 autophagy gene［J］.J Clin Invest，2003，112（12）：1809-1820.

［4］Zhang MY，Gou WF，Zhao S，et al.Beclin 1 expression is closely linked to colorectal carcinogenesis and distant metastasis of colorectal carcinoma［J］.Int J Mol Sci，2014，15（8）：14372-14385.

［5］Dong LW，Hou YJ，Tan YX，et al.Prognostic significance of Beclin 1 in intrahepatic cholangiocellular carcinoma［J］.Autophagy，2011，7（10）：1222-1229.

［6］Won KY，Kim GY，Lim SJ，et al.Decreased Beclin-1 expression is correlated with the growth of the primary tumor in patients with squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lung［J］.Hum Pathol，2012，43（1）：62-68.

［7］Kim HS，Lee SH，Do SI，et al.Clinicopathologic correlation of Beclin-1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma［J］. Pathol Res Pract，2011，207（4）：247-252.

［8］Koneri K，Goi T，Hirono Y，et al.Beclin 1 gene inhibits tumor growth in colon cancer cell lines［J］.Anticancer Res，2007，27（3B）：1453-1457.

［9］Huang JJ，Li HR，Huang Y，et al.Beclin 1 expression，a predictor of prognosis in patients with extranodal natural killer T-cell lymphoma，nasal type［J］.Autophagy，2010，6（6）：777-783.

［10］Koukourakis MI，Giatromanolaki A，Sivridis E，et al.Beclin 1 overand underexpression in colorectal cancer，distinct patterns relate to prognosis and tumour hypoxia［J］.Br J Cancer，2010，103（8）：1209-1214.

（編輯 陳 姜）

Clinicopathological Significance and Relevant Molecular Mechanisms of Beclin 1 in Gastric Cancer

ZHENG Hua-chuan，SHEN Dao-fu，YANG Xue-feng，SHI Shuai，GAO Yang，ZHAO Shuang，ZHANG Wen-lu

（Cancer Center，Key Laboratory of Brain and Spinal Cord Injury of Liaoning Province，Laboratory Animal Center，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo explore the role of Beclin 1 in gastric carcinogenesis and subsequent progression.MethodsMKN28 cells were transfected with Beclin 1-expressing plasmid，and then the proliferation and cell cycle was measured by CCK-8 and PI staining.Beclin 1 expression was examined by immunohistochemistry and in situ hybridization on tissue microarrays containing gastric cancers，adjacent non-neoplastic mucosa，and metastatic lymph node.The correlation with the tumorgenesis，clinicopathological and prognostic parameters was analyzed.ResultsBeclin 1 overexpression resulted in G2arrest of MKN28 cells and reduced the proliferation.Beclin 1 mRNAwas highly expressed in gastric cancer than matched mucosa by ISH（P＜0.05）.Beclin 1 was highly expressed in male than female patients with gastric cancer（P＜0.05）.The elder patients with gastric cancer had higher Beclin 1 expression than younger ones（P＜0.05）.The diffuse-type carcinomas showed less Beclin 1 expression than intestinal and mixed type ones（P＜0.05）.Kaplan-Meier analysis indicated that Beclin 1 expression was positively correlated to favorable prognosis of the cancer patients（P＜0.05）.ConclusionBeclin 1 expression is closely linked to pathogenesis，metastasis and differentiation ofgastric cancer.Beclin 1 mightbe employed to indicate the favorable prognosis of gastric cancer patients and regarded as a target of gene therapy.

gastric cancer；Beclin 1；pathogenesis；progression；prognosis

R731

A

0258-4646（2015）12-1061-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（81172371，81472544）；遼寧省教育廳優(yōu)秀人才計(jì)劃（LJQ2014093）；遼寧省科學(xué)技術(shù)廳2012年博士啟動(dòng)資助項(xiàng)目（20121095）；遼寧醫(yī)學(xué)院2012年博士啟動(dòng)項(xiàng)目（Y2012B018）；遼寧醫(yī)學(xué)院校長(zhǎng)基金（XZJJ20140201，XZJJ20140203）

鄭華川（1975-），男，教授，博士.

E-mail：zheng_huachuan@hotmail.com

2015-03-24

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：