魏 濤,杜聰聰,毛多斌,馬歌麗

(鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002)

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超嗜熱細菌Thermotogamaritima酯酶Tm1350克隆、表達及其酶學性質研究

魏 濤,杜聰聰,毛多斌,馬歌麗*

(鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002)

以超嗜熱細菌Thermotogamaritima基因組DNA為模板,通過PCR法擴增酯酶Tm1350基因,構建重組質粒pET15b-Tm1350,在大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)中實現(xiàn)表達,并采用p-NPA方法測定其酶活性。研究結果表明,酯酶Tm1350可以水解不同碳鏈長度(10C)的對硝基苯酚酯,其中對硝基苯酚戊酸酯(pNP-C5)是該酶最適合底物；該酶最適反應溫度和pH分別為70℃和6.5,90℃處理5h,仍有50%以上的酶活力,具有較強的熱穩(wěn)定性。酯酶Tm1350對金屬離子、抑制劑、變性劑和有機溶劑具有較強的抗性。

Thermotogamaritima,酯酶,克隆表達,酶學性質

酯酶(Esterases,EC 3.1.1.1)是一種能夠參與酯化、轉酯和酯交換等多種反應,并能水解多種含酰胺鍵、羧酯鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性及外源性物質的絲氨酸水解酶類[1-2]。酯酶作為一種高效的生物催化劑在精細化工、食品加工、醫(yī)藥工業(yè)、皮革制造、化妝品行業(yè)和污水整治等行業(yè)發(fā)揮著重要的作用[3-7]。然而,工業(yè)酶通常需要在高溫或有機相條件下發(fā)生催化反應,常溫酶在極端條件下的應用受到限制,因此提高酶的熱穩(wěn)定性和催化活性成為酶催化領域研究的熱點[8-9]。嗜熱酯酶具有良好的熱穩(wěn)定性和環(huán)境抗性,是生物催化領域新型的酶催化劑[10-12]。

超嗜熱菌海棲熱袍菌Thermotogamaritima是一種發(fā)現(xiàn)于55～90℃海底火山口周圍的嚴格厭氧菌,最適生長溫度在80℃左右[13]。生物信息學與基因組學研究發(fā)現(xiàn),嗜熱菌海棲熱袍菌T.maritima基因組中含有多個羧酸酯酶的基因。本研究將來自T.maritima的酯酶基因Tm1350在大腸桿菌中進行克隆表達,并進行了酶學性質研究,以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供一種新型的嗜熱酯酶催化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

T.maritima基因組DNA 南京農(nóng)業(yè)大學保存；表達載體pET-15b、菌株EscherichiacoliBL21(DE3)、E.coliDH5α 本實驗室保存；Pyrobest酶、DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeI、SalI 購自TAKARA生物科技公司；1kb DNA Ladder、Protein MW Marker 購自Fermentas公司；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 購自北京TIANGEN公司；Ni-NTA親和層析系統(tǒng) 購自GE Healthcare；對硝基苯酚酯 購自美國sigma公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

PCR儀 Thermo公司；低溫離心機 美國Sigma-Aldrich公司；凝膠成相系統(tǒng) Syngene公司；Y92-Ⅲ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2600系列紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；LDZX型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；QYC 211恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司；pH計 德國賽多利斯股份公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 酯酶Tm1350氨基酸序列同源性分析 利用NCBI Blast和Clustal W軟件,對T.maritima酯酶Tm1350及其同源蛋白氨基酸序列進行比對分析。

1.2.2 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中酯酶Tm1350的氨基酸序列,利用Genetyx軟件設計引物如下(下劃線部分表示限制性內(nèi)切酶NdeI和SalI的酶切位點):(F)5′-CGACCATATGAGAATGAA CATCCAGAAAC-3’(NdeI)和(R)5′-AGGCGTCGAC TTATTTCCCTCCGAGTTTTTCGAG-3′(SalI),由上海生工公司合成。

1.2.3T.maritima酯酶Tm1350的基因克隆 以提取嗜熱細菌T.Maritima基因組DNA為模板,PCR方法(100μL)擴增酯酶Tm1350基因。擴增條件:預變性:94℃,5min；變性:94℃,30s；退火:45s；延伸:72℃,2min；循環(huán)(30個)；延伸:72℃,10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。將純化目的基因片段與載體pET15b連接,構建重組質粒pET15b-Tm1350并送上海生工公司測序。

1.2.4 重組蛋白在大腸桿菌中的表達及純化 將重組質粒pET15b-Tm1350轉化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中,涂布至加入氨芐青霉素(Amp,100μg/L)和氯霉素(Chl,34μg/L)的LB平板上,37℃培養(yǎng)12～16h。挑取陽性轉化子單菌落于5mL含Amp和Chl的LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12h；按2%接種量接種到含Amp的300mL LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2～3h,使OD600在0.4～0.6；加入誘導劑IPTG至終濃度為0.5mmol/L,誘導表達蛋白；離心收集菌體,加入20mL破壁buffer(50mmol/L Tris-HCl,pH8.0,50mmol/L NaCl),超聲波破碎菌體后75℃熱處理30min；4℃,12000×g離心10min,上清即為蛋白粗酶液。采用鎳柱親和層析方法進行目的蛋白的純化,并利用蛋白質電泳(SDS-PAGE凝膠電泳)來檢測純化效果。蛋白質濃度用考馬斯亮藍比色Bradford方法測定。

1.2.5 酶活力的測定 酯酶活性測定采用p-NPA法[14-15]。酶活力單位定義為:在70℃和pH6.0條件下,每分鐘水解底物生成1μmol的對硝基苯酚所用的酶量為一個活力單位(U)。

1.2.6 重組酯酶Tm1350酶學性質研究

1.2.6.1 底物特異性 分別以硝基苯基乙酸酯(pNP-C2)、對硝基苯基丁酸酯(pNP-C4)、對硝基苯酚戊酸酯(pNP-C5)、對硝基苯基辛酸酯(pNP-C8)、對硝基苯基葵酸酯(pNP-C10)、對硝基苯基月桂酸酯(pNP-C12)和對硝基苯基棕櫚酸酯(pNP-C16)為反應底物,配制相同濃度底物(10mmol/L),于標準反應體系中測定酶活,測定酯酶Tm1350的底物特異性。

1.2.6.2 最適反應溫度與熱穩(wěn)定性 最適溫度測定:以10mmol/L對硝基苯酚戊酸酯作為反應底物,緩沖體系為50mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH6.5),反應時間為30min。在30～100℃范圍內(nèi),每隔5℃測酶活。酶的熱穩(wěn)定性:取相同濃度的酶置于不同溫度(70、80和90℃)下,分別保溫0～5h后,在標準體系下檢測酶活力。

1.2.6.3 最適反應pH 在不同pH(3.0～9.0)的緩沖液下測酶活。所用緩沖液為50mmol/L的檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0～4.0)、醋酸鈉緩沖液(pH4.5～6.0)、磷酸鈉緩沖液(pH6.5～8.0)和Tris-HCl緩沖液(pH8.5～9.0)。反應溫度為70℃,底物為對硝基苯酚戊酸酯,對照不加酶,以相應pH的緩沖液代替。

1.2.6.4 金屬離子、抑制劑及變性劑對酶活力的影響 在標準反應體系中分別加入不同的金屬離子溶液(Ni2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Ca2+、Pb2+和Cu2+)或EDTA至終濃度為5mmol/L,室溫放置60min,以對硝基苯酚戊酸酯為底物,以不加任何金屬離子的酶促反應物為對照,70℃反應測酶活。取稀釋酶液(10μg)分別加入體積比為1%和5%變性劑(Tween 20、Tween 80和SDS)以及5mmol/L抑制劑(PMSF、DEPC和DTT),處理30min后,將混合物加入標準酶催化反應體系中進行反應。

1.2.6.5 有機溶劑對酶活力的影響 取20μL稀釋酶液(10μg)分別加入體積分數(shù)為50%或90%的有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、正己烷和DMSO)處理2h后,加入標準酶催化反應體系,以不經(jīng)有機溶劑處理的酶促反應物為對照,測定酶活。

2 結果與討論

2.1 酯酶Tm1350氨基酸序列分析

NCBI網(wǎng)站中Blast分析嗜熱酯酶Tm1350的同源序列,發(fā)現(xiàn)在嗜熱細菌ThermococcusgammatoleransEJ3、Thermotoganeapolitana和嗜熱古菌Pyrocococusfurious、PyrococcusabyssiGE5和FervidobacteriumnodosumRt17-B1等中存在同源蛋白,相似性介于62%～68%之間,利用軟件Clustal W2.1比對酯酶Tm1350的同源序列,結果如圖1所示,在該酯酶家族中存在LFGHSLGGL保守結構域；Ser103、Asp183和His249為嗜熱酯酶Tm1350可能的催化活性中心,組成該酶的催化三聯(lián)結構。

圖1 Tm1350的序列比對及同源性分析Fig.1 Multiple sequence alignmentfor Tm1350 and its homologs注:右邊序號代表氨基酸的位置；陰影部分為保守序列；“*”、“:”、“.”分別代表保守的和半保守氨基酸位點；“▲”代表催化活性中心；方框部分代表保守結構域；Tm1350:Thermotoga maritima(WP_010865324)；TGAN_0950:Thermococcus gammatolerans EJ3(WP_015858566)；PF0480:Pyrocococus furious(WP_011011597)；PAB1050:Pyrococcus abyssi GE5(WP_010868712)；Fnod_1513:Fervidobacterium nodosum Rt17-B1(WP_011994661)；CTN_1241:Thermotoga neapolitana DSM 4359(WP_015919732)。

2.2 嗜熱酯酶Tm1350基因克隆及表達

以T.maritima基因組DNA為模板,PCR擴增片段與預期大小基本相符(780bp)。重組質粒pET15b-Tm1350經(jīng)NdeI和SalI雙酶切和DNA測序分析,嗜熱酯酶Tm1350成功克隆到載體pET15b。重組質粒pET15b-Tm1350在大腸桿菌BL21(DE3)表達后,經(jīng)超聲波破壁、70℃熱處理和鎳柱親和層析,得到純化重組酯酶Tm1350的單一條帶。經(jīng)過考馬斯亮藍比色法測定蛋白濃度,純化后酶濃度約為25μg/mL(酶濃度濃度標準曲線方程Y=1.0601X-0.025,R2=0.9987)。由SDS-PAGE結果,推測該酶分子量約為28ku,與預期分子量(氨基酸計算)基本一致。

2.3 酯酶Tm1350酶學性質的研究

2.3.1 酯酶Tm1350的底物特異性 以不同鏈長的對硝基苯基酯底物,檢測酯酶Tm1350的底物特異性。由圖3可知,該酶水解碳鏈長度小于10對硝基苯酚酯的活力較強,即pNP-C5>pNP-C8>pNP-C4>pNP-C2>pNP-C10>pNP-C12>pNP-C14>pNP-C16,其中最適水解底物為pNP-C5(對硝基苯酚戊酸酯)(135.31U/mg)。底物特異性實驗結果表明,Tm1350在分類上屬于真酯酶,不屬于脂肪酶[14]。

圖2 SDS-PAGE檢測重組蛋白在E. Coli BL21中的表達和純化Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression and purification of the recombinant esterase注:M:蛋白Marker；1:菌體超聲破碎后全蛋白；2:熱處理并離心后上清粗蛋白；3:鎳柱親和層析純化后蛋白。

圖3 酯酶Tm1350底物特異性Fig.3 The substrate specificity of Tm1350 towards different pNP-esters

2.3.2 酯酶Tm1350最適反應溫度與熱穩(wěn)定性 溫度對酶活的影響包括兩方面內(nèi)容:酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性。如圖4所示,酯酶Tm1350最適合反應溫度為70℃,且該酶在30～100℃較寬溫度范圍內(nèi)都有50%以上的活性。熱穩(wěn)定性實驗表明,在90℃處理5h,仍然保持50%以上的活性(如圖5),說明該酶的熱穩(wěn)定性非常強。

圖4 酯酶Tm1350最適反應溫度Fig.4 Optimum temperature of the esterase Tm1350

2.3.3 酯酶Tm1350最適反應pH 如圖6所示,酯酶Tm1350最適pH為6.5,與已報道嗜熱酯酶的最適pH(6～8)基本相符[1]。

圖5 酯酶Tm1350熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermostability of the esterase Tm1350

圖6 酯酶Tm1350最適反應pHFig.6 Optimum pH of the esterase Tm1350

2.3.4 金屬離子及抑制劑對嗜熱酯酶Tm1350酶活力的影響 檢測不同金屬離子(5mmol/L)對酶活的影響,包括Ni2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Ca2+、Pb2+和Cu2+。結果如表1所示,Ba2+和Mg2+對酶活的影響較小,而Ni2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+、Pb2+和Cu2+對酯酶Tm1350活性有不同抑制作用,相對酶活分別降至原來的63%、59%、47%、43%、41%和14%。5mmol/L的金屬螯合劑EDTA對酶活也沒有明顯影響,說明該酶不屬于金屬依賴型的酶。在5mmol/L 還原劑DTT作用下,該酶保持13% 活性；抑制PMSF和DEPC(5mmol/L)對酶活性具有明顯抑制作用(為起始酶活的51%和完全抑制),說明絲氨酸和組氨酸殘基在酶的催化過程中起重要作用,這與氨基酸序列分析結果一致[1]。

表1 金屬離子及抑制劑對嗜熱酯酶Tm1350酶活力影響Table1 Effect of metal ions and inhibitors on the enzyme activity of the esterase Tm1350

2.3.5 有機溶劑及變性劑對嗜熱酯酶Tm1350酶活力的影響 在許多工業(yè)生產(chǎn)中都用到有機溶劑,因此有機溶劑對酶活的影響非常重要。表2是不同的有機溶劑對酶活性的影響。如表2所示,甲醇、乙醇、丙酮、正己烷和DMSO在體積比為50%和90%時對酶活的影響不大,只有90%氯仿抑制酶活到原來酶活的33%。變性劑SDS、Tween-20和TritonX-100(1%或5%,w/v)對酯酶Tm1350活性影響不明顯。酯酶Tm1350在多數(shù)有機溶劑中比較穩(wěn)定,這使其能夠在生物催化反應中具有重要應用前景。

表2 有機溶劑及變性劑對嗜熱酯酶Tm1350酶活力的影響Table2 Effect of organic solvents and detergents on the enzyme activity of the esterase Tm1350

3 結論

本文將來自超嗜熱細菌T.maritima嗜熱酯酶Tm1350在E.coliBL21(DE3)中成功克隆表達,通過IPTG誘導表達蛋白、超聲破碎、熱處理和鎳柱親和層析,得到純化的重組酶。SDS-PAGE分析表明,該酯酶分子量約28ku。酶學性質研究表明,該酯酶對不同硝基苯酚酯底物具有不同水解活性,活性大小為pNP-C5>pNP-C8>pNP-C4>pNP-C2>pNP-C10>pNP-C12>pNP-C14>pNP-C16,其中pNP-C5(對硝基苯酚戊酸酯)為該酶最佳水解底物；酯酶Tm1350最適反應溫度和最適作用pH分別為70℃和6.5,該酯酶于90℃處理5h,仍有50%以上的酶活力,具有較強的熱穩(wěn)定性。酯酶Tm1350對有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮、正己烷和DMSO)和變性劑(SDS、Tween-20和TritonX-100)表現(xiàn)出較強的抗性,因此在生物催化中具有廣闊的開發(fā)應用前景。

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Cloning,expression and characterization of the esterase Tm1350 from hyperthermophilic bacteriaThermotogamaritima

WEI Tao,DU Cong-cong,MAO Duo-bin,MA Ge-li*

(School of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China)

The esterase gene Tm1350 fromThermotogamaritimawas amplified by PCR method and recombinant plasmid pET15b-Tm1350 was constructed to express the enzyme inEscherichiacoliBL21(DE3). Esterase activity was determined spectrophotometrically by the p-NPA method using p-nitrophenyl esters of various chain lengths as the substrates. The enzyme could hydrolyze the substrates of pNP-esters with acyl chains of different lengths and exhibited the highest activity for pNP-C5 among the substrates tested. Tm1350 displayed optimal activity at 70℃ and 6.5. It maintained above 50% activity after 5h incubation at 90℃,which indicated that the enzyme showed strong thermal stability. The recombinant esterase Tm1350 was found to have strong resistances to metal ions,inhibitor,denaturant and organic solvents.

Thermotogamaritima;esterase;cloning and expression;enzymatic property

2014-07-25

魏濤(1980-)，男，博士，副教授，研究方向：食品酶技術。

*通訊作者:馬歌麗(1962-)，女，碩士，教授，研究方向：酶工程。

河南省重點科技攻關項目(132102120197)。

TS201.3

A

:1002-0306(2015)09-0179-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.031