周軒，郭行磐，陳芋如，李家樂(lè)，楊金龍

(上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心，上海201306)

厚殼貽貝Mytilus coruscus為中國(guó)重要的貝類養(yǎng)殖品種和主要的筏式養(yǎng)殖貝類品種，其分布于黃海、渤海和東海沿岸［1］，其中以浙江沿海資源量最大。近年來(lái)，因過(guò)度采捕導(dǎo)致厚殼貽貝自然資源逐漸減少，自然海區(qū)附苗數(shù)量和質(zhì)量明顯下降，厚殼貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)也受到嚴(yán)重影響。目前，厚殼貽貝規(guī)?；斯し敝臣夹g(shù)一直未得到很好的解決，育苗數(shù)量不穩(wěn)定，導(dǎo)致苗種供不應(yīng)求［2］。厚殼貽貝幼蟲(chóng)在完成浮游生活階段后，附著變態(tài)成為稚貝，最終發(fā)育為成貝［3］。與許多其他海洋無(wú)脊椎動(dòng)物不同，當(dāng)環(huán)境變化時(shí)，貽貝稚貝能夠自行切斷足絲，開(kāi)始爬行并重新選擇附著基進(jìn)行再次附著。

在海洋環(huán)境中，微生物被膜存在于幾乎所有固體附著基質(zhì)的表面［4］。海洋細(xì)菌黏附到基質(zhì)表面并分泌胞外產(chǎn)物，從而形成細(xì)菌黏膜，是微生物被膜形成的關(guān)鍵階段，在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)的附著變態(tài)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。附著基質(zhì)的表面濕度影響海洋細(xì)菌的附著、微生物被膜的形成和海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)的附著［5-6］。然而，形成于低濕度表面的海洋細(xì)菌對(duì)稚貝附著影響的研究鮮有報(bào)道。本研究中，從硅烷化處理后的載玻片上形成的自然微生物被膜中分離和純化海洋附著細(xì)菌，研究了單一菌株形成的微生物被膜對(duì)厚殼貽貝稚貝附著的影響，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析其遺傳距離與貽貝附著的相互關(guān)系，查明厚殼貽貝稚貝附著行為與海洋細(xì)菌的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步研究厚殼貽貝稚貝的附著機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用厚殼貽貝稚貝取自浙江嵊泗縣東海貽貝科技創(chuàng)新服務(wù)有限公司，殼長(zhǎng)為 (1．80±0．05)mm，殼高為 (1．17±0．03)mm，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)1周后用于試驗(yàn)。暫養(yǎng)期間，溫度控制在18℃，充氣培養(yǎng)，每天換水1次并投喂金藻。

試驗(yàn)用海洋細(xì)菌來(lái)源于浙江舟山嵊泗海域自然微生物被膜，利用ZoBell 2216E平板培養(yǎng)法分離純化得到單株，進(jìn)行試驗(yàn)。掛板所用載玻片經(jīng)過(guò)二氯二甲基硅烷(Dichlorodimethylsilane，DMS)(Sigma公司)處理。

1.2 方法

1．2．1 海洋細(xì)菌的分離 參考 Yang等［7］的方法，使用無(wú)菌載玻片將微生物被膜從載玻片表面刮至滅菌過(guò)濾海水 (AFSW)中，形成懸浮液。經(jīng)倍比稀釋后，滴適量涂布于ZoBell 2216E瓊脂平板上，在25℃、黑暗條件下培養(yǎng)48 h后，挑取菌落，在平板上反復(fù)劃線分離純化，得到純種菌株，并在15%的甘油溶液 (用體積分?jǐn)?shù)為0．9%的生理鹽水配制)中保存 (-80℃)備用。

1．2．2 細(xì)菌16S rRNA基因序列的鑒定

(1)DNA提取。將海洋細(xì)菌加入到100 μL無(wú)菌蒸餾水中，用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒 (上海博彩生物科技有限公司)提取。

(2)PCR擴(kuò)增。采用細(xì)菌16S rDNA序列通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物為27F(5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3')和1492R(5'GGTTACCTTGTTACGACTT 3')。擴(kuò)增總體系 (共25 μL):模板DNA 2 μL，4×dNTPs(10 μmol/L)0．5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0．2 μL，引物(20 pmol/μL)各 0．5 μL，10×擴(kuò)增緩沖液 (含 Mg2+)2．5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)在銀制梯度PCR儀 (Eppendorf公司)上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，每一循環(huán)遞減0．5℃，72℃下延伸2 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸8 min，于-20℃下保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海邁浦生物技術(shù)有限公司測(cè)序，獲得的序列通過(guò)Blast 程 序 與 GENEBAN(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，確定其菌名。

1．2．3 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析 將得到的序列與有親緣關(guān)系的序列在Mega 5．05軟件的CLUSTALW程序上進(jìn)行分析。使用Mega 5．05軟件的鄰接法 (NJ)、最大簡(jiǎn)約法 (MP)和最小進(jìn)化分析法 (1000次重復(fù))構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。用Jukes-Cantor方法計(jì)算遺傳距離。從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中得到Escherichia coli(序列號(hào) AONF01000005．1)作為外群序列，用于構(gòu)建細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1．2．4 微生物被膜的制備 參考Yang等［7］的方法，挑取純種菌株到100 mL ZoBell 2216E液體培養(yǎng)基上，在25℃、黑暗條件下擴(kuò)大培養(yǎng)48 h后，離心洗滌 (1600 g，15 min)濃縮到50 mL并制成懸浮液。用0．1%吖啶橙染色5 min，在1000倍熒光顯微鏡(奧林巴斯BX51)下隨機(jī)選取10個(gè)點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定細(xì)菌總密度。先將載玻片放入滅菌培養(yǎng)皿 (Φ64 mm×19 mm)中，隨后添加細(xì)菌，通過(guò)無(wú)菌海水定容至20 mL，每株細(xì)菌的初始密度分別為 1×106、3×106、5×106、10×106cells/mL，18℃、黑暗條件下培養(yǎng)48 h后形成微生物被膜。

1．2．5 細(xì)菌密度的計(jì)數(shù) 微生物被膜被固定在體積分?jǐn)?shù)為5%的福爾馬林溶液中。固定后的微生物被膜經(jīng)AFSW 清洗3次，用0．1%吖啶橙染色5 min后，在1000倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定不同初始密度的細(xì)菌最終形成微生物被膜的終密度。

1．2．6 稚貝附著試驗(yàn) 在每個(gè)滅菌培養(yǎng)皿中加入20 mL AFSW，并放入1個(gè)附有微生物被膜的載玻片和10枚稚貝。在試驗(yàn)的12 h和24 h時(shí)，記錄稚貝的附著率，即載玻片上附著的稚貝個(gè)數(shù)占該培養(yǎng)皿中稚貝總個(gè)數(shù)的百分比。每株細(xì)菌設(shè)置9個(gè)平行組，以空白載玻片作為對(duì)照，每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)空白對(duì)照組，均在18℃、黑暗條件下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

細(xì)菌誘導(dǎo)附著的活性用附著率表示，將百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)化。在統(tǒng)計(jì)分析之前，所有的數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。如不滿足正態(tài)性分布，則通過(guò)Kruskal-Wallis Test進(jìn)行評(píng)估檢驗(yàn)。同時(shí)，進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。采用JMP 10．0．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平設(shè)為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海洋細(xì)菌對(duì)厚殼貽貝稚貝附著的影響

表1為試驗(yàn)過(guò)程中所使用的海洋細(xì)菌。9株細(xì)菌在試驗(yàn)12 h和24 h時(shí)對(duì)厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)結(jié)果基本相似，因此，本研究中僅列出12 h的誘導(dǎo)效果，其結(jié)果如圖1所示?？瞻讓?duì)照組稚貝的附著率僅為17%±3%，與空白對(duì)照組相比，所有測(cè)試菌株均顯著誘導(dǎo)厚殼貽貝稚貝附著 (P＜0．05)。從圖 1可見(jiàn):Bacillus sp．2的誘導(dǎo)活最高性，其附著率最高為68%±2%;Nautella sp．1的誘導(dǎo)活性最低，其附著率最高為38%±3%;其余7株細(xì)菌表現(xiàn)出中等程度的誘導(dǎo)活性。

表1 海洋細(xì)菌16S rDNA基因序列分析Tab.1 16S rDNA gene sequence analysis of the marine bacterial strains

圖1 不同海洋細(xì)菌對(duì)厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)作用Fig.1 Percentages of settlement of juvenile mussel Mytilus coruscus on the nine monospecific bacterial biofilms

2.2 細(xì)菌終密度對(duì)稚貝附著率的影響

不同微生物被膜終密度對(duì)稚貝附著的影響如圖2所示。從圖 2可見(jiàn):Bacillus sp．2在 9．0×106cells/cm2低密度時(shí)呈現(xiàn)出最高誘導(dǎo)活性，而在高密度時(shí)誘導(dǎo)活性顯著下降 (P＜0．05)。同樣，Alteromonas sp．1 在 1．3×107cells/cm2高密度時(shí)，其誘導(dǎo)的稚貝附著率顯著下降 (P＜0．05)。稚貝附著與細(xì)菌終密度之間的關(guān)系如表2所示。從表2可見(jiàn):除Pseudoalteromonas sp．3的終密度與稚貝附著率無(wú)顯著相關(guān)性外 (P＞0．05)，其余8株海洋細(xì)菌終密度與稚貝附著率均顯著相關(guān) (P＜0．05)。

2.3 初始細(xì)菌密度對(duì)微生物被膜形成的影響

初始細(xì)菌密度對(duì)微生物被膜形成的影響如圖3所示。從圖 3可見(jiàn):初始細(xì)菌密度為 1×106cells/mL時(shí)，Bacillus sp．2形成微生物被膜的終密度最高;初始細(xì)菌密度為3×106cells/mL時(shí)，Acinetobacter sp．1形成微生物被膜的終密度最高;初始細(xì)菌密度為5×106cells/mL時(shí)，Microbacterium sp．1形成微生物被膜的終密度最高;初始細(xì)菌密度為10×106cells/mL 時(shí)，Pseudoalteromonas sp．2形成微生物被膜的終密度最高。在4種初始密度下，Pseudoalteromonas sp．1形成微生物被膜的終密度均為最低。

表2 細(xì)菌終密度與誘導(dǎo)活性的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between the final bacterial density and inducing activity in biofilms

圖2 單一菌株形成微生物被膜的終密度對(duì)厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)作用Fig.2 Percentages of settlement of juvenile mussel Mytilus coruscus on monospecific bacterial biofilms at various densities

2.4 海洋細(xì)菌的序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用不同的方法和模式進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，測(cè)試菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖4所示。Pseudoalteromonas sp．1 與 Alteromonas sp．1 之間的遺傳距離為0．109，分屬于兩個(gè)不同的屬，都表現(xiàn)出中等程度的誘導(dǎo)活性。相反，Bacillus sp．2和Bacillus sp．1之間的遺傳距離只有0．074，同屬于芽孢桿菌屬，但前者的誘導(dǎo)活性顯著高于后者 (P＜0．05)。 同 時(shí)， Pseudoalteromonas sp．1、Pseudoalteromonas sp．2 和 Pseudoalteromonas sp．3 兩兩之間的遺傳距離最大為0．004，屬于假交替單胞菌屬，均表現(xiàn)出中等程度的誘導(dǎo)活性，但形成微生物被膜的終密度差異較大。

3 討論

圖3 不同初始細(xì)菌密度下形成微生物被膜的終密度變化 (n=30)Fig.3 Density of monospecific bacterial biofilms under different initial densities(n=30)

許多海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼體選擇在具有一定理化性質(zhì)的附著基表面進(jìn)行附著［5-6］，附著基的材質(zhì)、表面粗糙度、表面濕度、表面張力、微貌結(jié)構(gòu)等特性對(duì)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物附著均有不同程度的影響［5］。然而，以往研究主要集中在附著基質(zhì)表面性質(zhì)與海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的附著關(guān)系，而關(guān)于附著基質(zhì)表面形成微生物被膜的研究鮮有報(bào)道。海洋細(xì)菌能夠通過(guò)形成微生物被膜而改變附著基表面的理化性質(zhì)，從而在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)附著過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［8-11］。本研究中首次證明，來(lái)源于低濕度表面的海洋細(xì)菌能夠有效誘導(dǎo)厚殼貽貝稚貝的附著。

圖4 細(xì)菌16S rDNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences from bacterial isolates using the Neighbor－Joining method and the Jukes－Cantor model

附著細(xì)菌是海洋微生物被膜的重要構(gòu)成生物之一。以往研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌密度與一些海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)附著相關(guān)。在自然微生物被膜中，Wang等［12］研究表明，微生物被膜中的附著細(xì)菌密度與厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著顯著相關(guān)。在對(duì)單一菌株的研究中，Huang等［13］分析了細(xì)菌密度對(duì)微生物被膜形成的影響，并探討了其對(duì)華美盤管蟲(chóng)Hydroides elegans幼蟲(chóng)附著的影響，研究結(jié)果表明，單一菌株形成微生物被膜的最終密度與細(xì)菌初始密度顯著相關(guān)，且與該幼蟲(chóng)的附著變態(tài)顯著相關(guān)。然而，Tran等［14］研究表明，盡管初始細(xì)菌密度影響所形成單一菌株微生物被膜的最終密度，但僅1株高誘導(dǎo)活性菌株的密度與鹿角杯形珊瑚Pocillopora damicornis幼蟲(chóng)附著顯著相關(guān)，其他菌株的密度則與幼蟲(chóng)附著無(wú)相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，初始細(xì)菌密度明顯影響微生物被膜的最終密度，且5株海洋附著細(xì)菌的終密度與厚殼貽貝稚貝附著呈正相關(guān)，4株呈負(fù)相關(guān)，僅1株細(xì)菌的終密度與稚貝附著無(wú)相關(guān)性。由此可見(jiàn)，細(xì)菌密度與厚殼貽貝稚貝的附著有著密切的聯(lián)系。本研究結(jié)果還表明，海洋細(xì)菌形成微生物被膜的誘導(dǎo)活性并非隨細(xì)菌密度的升高而逐漸升高，而均在最適密度下活性達(dá)到最大，隨后下降，這表明特定細(xì)菌存在一個(gè)閾值效應(yīng)，且微生物被膜中細(xì)菌密度與誘導(dǎo)活性之間的線性關(guān)系取決于特定的菌株。本研究結(jié)果與Yang等［7］對(duì)細(xì)菌密度與厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著關(guān)系的研究結(jié)果極為相似。研究表明，海洋細(xì)菌中的化學(xué)信號(hào)物質(zhì)參與了貽貝幼蟲(chóng)的附著過(guò)程［7，15］，而本研究中厚殼貽貝稚貝附著同樣可能與特定菌株分泌的化學(xué)誘導(dǎo)信號(hào)物質(zhì)有關(guān)，這需要進(jìn)一步地研究證實(shí)。

海洋細(xì)菌種屬也與海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼體附著有密不可分的關(guān)系。Bao等［16］在研究交替單胞菌Alteromonas sp．1對(duì)地中海紫貽貝 Mytilus galloprovincialis幼蟲(chóng)附著變態(tài)時(shí)，發(fā)現(xiàn)此菌對(duì)紫貽貝幼蟲(chóng)有顯著的誘導(dǎo)活性，且來(lái)源于該菌中的化學(xué)信號(hào)物質(zhì)參與了幼蟲(chóng)的附著變態(tài)過(guò)程。本研究結(jié)果也表明，該菌屬對(duì)厚殼貽貝稚貝具有誘導(dǎo)活性。由此推測(cè)，該菌對(duì)不同種屬貽貝附著均有一定程度的誘導(dǎo)活性，這一菌屬均可分泌不同化學(xué)信號(hào)物質(zhì)來(lái)促進(jìn)貽貝附著，然而其具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。另外，本試驗(yàn)中同屬于芽孢桿菌屬的Bacillus sp．2和Bacillus sp．1對(duì)厚殼貽貝稚貝的誘導(dǎo)活性顯著不同，而不同屬的 Pseudoalteromonas sp．1和 Alteromonas sp．1對(duì)厚殼貽貝稚貝的誘導(dǎo)活性相似，此結(jié)果符合Yang等［7］的研究結(jié)論，即海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)的附著變態(tài)與細(xì)菌種屬無(wú)特定關(guān)聯(lián)。但是假交替單胞菌屬的3株細(xì)菌均表現(xiàn)出中等誘導(dǎo)活性，又與此結(jié)論相悖，所以這進(jìn)一步證實(shí)了海洋細(xì)菌對(duì)厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)作用與細(xì)菌種屬無(wú)必然聯(lián)系，可能與它們分泌的胞外代謝產(chǎn)物的種類以及形成微生物被膜的具體結(jié)構(gòu)相關(guān)［15，17］。

附著基表面濕度能夠影響細(xì)菌群落的構(gòu)成。Huggett等［18］研究表明，低表面濕度附著基對(duì)附著其上的表面細(xì)菌群落有一定的影響，從而抑制華美盤管蟲(chóng)幼蟲(chóng)的附著。本研究中，9種海洋細(xì)菌均從低濕度表面形成的微生物被膜中分離所得，研究結(jié)果表明，細(xì)菌對(duì)厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)活性都比較高且與表面濕度的關(guān)系不明顯。這與Yang等［7］從自然微生物被膜和貽貝貝殼等不同表面分離的細(xì)菌對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)影響的研究結(jié)果一致。

綜上所述，從低濕度附著基表面分離的海洋細(xì)菌形成單一菌株的微生物被膜能夠有效促進(jìn)厚殼貽貝稚貝的附著，附著率與細(xì)菌密度顯著相關(guān)，但與細(xì)菌的種屬無(wú)顯著相關(guān)性。本研究成果對(duì)于今后闡明厚殼貽貝附著機(jī)制的研究具有重要的理論意義。

［1］常亞青．貝類增養(yǎng)殖學(xué)［M］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007．

［2］?？姑?，吳劍鋒．厚殼貽貝人工繁殖技術(shù)的研究［J］．南方水產(chǎn)，2007，3(3):26-30．

［3］李太武．海洋生物學(xué)［M］．北京:海洋出版社，2013:172-210．

［4］Wahl M，Goecke F，Labes A，et al．The second skin:ecological role of epibiotic biofilms on marine organisms［J］．Front Microbiol，2012，3:1-21．

［5］Dürr S，Thomason J C．Biofouling［M］．Oxford(UK):Wiley-Blackwell，2010．

［6］Carl C，Poole A J，Sexton B A，et al．Enhancing the settlement and attachment strength of pediveligers of Mytilus galloprovincialis by changing surface wettability and microtopography［J］．Biofouling，2012，28:175-186．

［7］Yang J L，Shen P J，Liang X，et al．Larval settlement and metamorphosis of the mussel Mytilus coruscus in response to monospecific bacterial biofilms［J］．Biofouling，2013，29:247-259．

［8］Ganesan A M，Alfaro A C，Brooks J D，et al．The role of bacterial biofilms and exudates on the settlement of mussel(Perna canaliculus)larvae［J］．Aquaculture，2010，306:388-392．

［9］Huggett M J，Williamson J E，Kjelleberg E，et al．Larval settlement of the common Australian sea urchin Heliocidaris erythrogramma in response to bacteria from the surface of coralline algae［J］．Oecologia，2006，149:604-619．

［10］Hadfield M G．Biofilms and marine invertebrate larvae:what bacteria produce that larvae use to choose settlement sites［J］．Ann Rev Mar Sci，2011，3:453-470．

［11］Lau S C K，Thiyagarajan V，Qian P Y．The bioactivity of bacterial isolates in Hong Kong waters for the inhibition of barnacle(Balanus amphitrite Darwin)settlement［J］．J Exp Mar Biol Ecol，2003，282(1/2):43-60．

［12］Wang C，Bao W Y，Gu Z Q，et al．Larval settlement and metamorphosis of the mussel Mytilus coruscus in response to natural biofilms［J］．Biofouling，2012，28(3):249-256．

［13］Huang S，Hadfield M G．Composition and density of bacterial biofilms determine larval settlement of the polychaete Hydroides elegans［J］．Mar Ecol Prog Ser，2003，260:161-172．

［14］Tran C，Hadfield M G．Larvae of Pocillopora damicornis settle and metamorphose in response to surface-biofilm bacteria［J］．Mar Ecol Prog Ser，2011，433:85-96．

［15］Chung H C，Lee O O，Huang Y L，et al．Bacterial community succession and chemical profiles of subtidal biofilms in relation to larval settlement of the polychaete Hydroides elegans［J］．ISME J，2010，4:817-828．

［16］Bao W Y，Yang J L，Satuito C G，et al．Larval metamorphosis of the mussel Mytilus galloprovincialis in response to Alteromonas sp．1:evidence for two chemical cues［J］．Mar Biol，2007，152:657-666．

［17］Scardino A J，Guenther J，de Nys R．Attachment point theory revisited:the fouling response to a microtextured matrix［J］．Biofouling，2008，24:45-53．

［18］Huggett M J，Nedved B T，Hadfield M G．Effects of initial surface wettability on biofilm formation and subsequent settlement of Hydroides elegans［J］．Biofouling，2009，25:387-399．