斑馬魚CYP11a1基因在不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

陳孝紅，仇雪梅，郝薇薇，王秀利

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

摘要:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析了斑馬魚Danio rerio的CYP11a1基因在成魚4個(gè)組織和性腺發(fā)育3個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果表明：CYP11a1基因在卵巢、精巢、肌肉和腦組織中均有表達(dá)且存在差異，在腦中表達(dá)量最低(P<0.05)，在卵巢、精巢、肌肉中的表達(dá)量分別為腦中表達(dá)量的204.7倍、38.9倍、17.0倍;CYP11a1基因在3個(gè)卵巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，其在卵巢成熟期的表達(dá)量最低(P>0.05)，在卵巢成熟前期、卵巢成熟后期的表達(dá)量分別為卵巢成熟期表達(dá)量的1.7倍、1.5倍；CYP11a1基因在3個(gè)精巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，在精巢成熟期表達(dá)量最高(P<0.05)，分別為精巢成熟前期、精巢成熟后期表達(dá)量的6.5倍、13.4倍。研究表明，盡管CYP11a1基因在卵巢和精巢發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律不同，但CYP11a1基因在一定程度上與斑馬魚的性腺發(fā)育相關(guān)，其可能在促進(jìn)斑馬魚精子成熟中發(fā)揮一定作用。

關(guān)鍵詞:斑馬魚；CYP11a1基因；性腺發(fā)育

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.01.003

文章編號(hào)：2095-1388(2015)01-0013-05

中圖分類號(hào)：Q45

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2014-04-29

基金項(xiàng)目：國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201405003)

作者簡(jiǎn)介：陳孝紅(1988—)， 女， 碩士研究生。E-mail:xh_chen2011@163.com

Abstract：The expression of CYP11a1 gene was studied and analyzed in four tissues and three development phases in gonad of zebrafish Danio rerio by quantitative Real-time PCR (qRT-PCR). It was found that the CYP11a1 gene was expressed in ovary, testis, muscle and brain, the minimum in brain(P<0.05)， 204.7 times higher in ovary, 38.9 times higher in testis, and 17.0 times higher in muscle compared with that in brain, indicating that the CYP11a1 gene showed a certain extent tissue difference in expression. The qRT-PCR analysis revealed that the expression of CYP11a1 gene was found to be decreased first in the early development phases of ovary and then enhanced in the later development phases of ovary, the minimum at maturity phase(P>0.05), 1.7 times higher before sexual maturity and 1.5 times higher after sexual maturity compared with that at maturity phase. In the testis, however, the expression of CYP11a1 gene was found to be enhanced first in the early development phases of testis and then decreased in the later development phases of testis, the maximum at the sexual maturity(P<0.05), 6.5 times higher before sexual maturity and 13.4 times higher than that after the sexual maturity. The findings indicated that the expression of CYP11a1 gene was involved in gonad development and spermatogenesis in zebrafish, though the expression pattern of CYP11a1 gene was different in the ovary and the testis.

斑馬魚Daniorerio隸屬于鯉科、短擔(dān)尼魚屬，是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值的熱帶觀賞魚。由于其具有果蠅、小鼠等模式生物不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如繁殖能力強(qiáng)、體外受精、胚胎透明、發(fā)育快、性成熟周期短、可追蹤整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程等，因此，其特別適合作為研究生長(zhǎng)與發(fā)育、性別決定、性別分化相關(guān)基因表達(dá)與功能的模式生物。目前，斑馬魚已被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、生殖發(fā)育生物學(xué)、生態(tài)學(xué)等[1]研究中。

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)基因家族是一類編碼參與一些內(nèi)源性物質(zhì)(如激素、膽固醇)和外源性物質(zhì)(如藥物、環(huán)境化合物)代謝的酶系超基因家族[2]。由CYP基因編碼的CYP450酶屬于血紅蛋白酶類，是一類以血紅素為輔基的細(xì)胞色素蛋白酶超家族，廣泛存在于生物體內(nèi)。斑馬魚中共存在94種CYP基因，分布于18個(gè)基因家族，而且這些基因家族同樣存在于哺乳動(dòng)物中[3]。CYP基因家族中由CYP1~CYP4基因編碼的酶大多與藥物代謝相關(guān)，研究表明，魚類CYP3a等基因可能與哺乳動(dòng)物中的一樣，在藥物代謝中起著重要作用[4]。CYP基因家族CYP5~CYP51中有32個(gè)與人類的CYP基因同源，并且由這些基因編碼的酶大多與生物體內(nèi)激素代謝有關(guān)，在生物性腺發(fā)育中起一定作用，如CYP17、CYP19、CYP51等。由CYP11a1基因編碼的膽固醇側(cè)鏈裂解酶，簡(jiǎn)稱P450scc，是一種線粒體酶[5]，其催化膽固醇為孕烯醇酮，啟動(dòng)生物體內(nèi)類固醇激素合成的第一步，是這個(gè)合成途徑的限速步驟和關(guān)鍵的調(diào)控位點(diǎn)[6-7]。由CYP11a1基因編碼的細(xì)胞色素P450scc切斷C20/C22之間的碳碳鍵，將底物縮短6個(gè)碳原子[8]。從膽固醇到孕烯醇酮的轉(zhuǎn)變過(guò)程中需要經(jīng)過(guò)3次單加氧反應(yīng)，2次膽固醇側(cè)鏈羥基化反應(yīng)，最后，C22和C20之間的碳鍵斷裂，最終形成孕烯醇酮和異癸酸[9]。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于斑馬魚CYP11a1基因的研究較少。本研究中分析了斑馬魚CYP11a1基因在不同組織及不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，以期探討CYP11a1基因在斑馬魚性腺發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)規(guī)律及與性腺發(fā)育、分化的相關(guān)性，旨在為進(jìn)一步研究CYP11a1基因在斑馬魚性腺發(fā)育、性別決定與性別分化中的功能提供參考。

通信作者： 仇雪梅(1964—)， 女， 教授。E-mail:xmqiu@dlou.edu.cn

1材料與方法

1.1　材料

試驗(yàn)用魚為農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的1齡斑馬魚，體長(zhǎng)約3 cm。日常以商品餌料(脫殼鹵蟲卵)為主要餌料，每日投喂2~3次，每次投喂量以斑馬魚在5 min內(nèi)吃完為宜，水溫控制在25 ℃左右。

1.2　方法

1.2.1CYP11a1基因在斑馬魚成魚4個(gè)組織中的表達(dá)取健康雌、雄斑馬魚成魚各30尾，平均分為3組，取卵巢、精巢、肌肉和腦4種組織。為消除個(gè)體差異，將每組中同一組織的混合樣為一個(gè)樣本，放入一個(gè)去RNA酶處理的1.5 mL離心管中并立即放入液氮中，置于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2CYP11a1基因在斑馬魚不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)依據(jù)石蠟切片判斷試驗(yàn)魚的性腺發(fā)育時(shí)期，并于2013年5月至11月采集樣本，在性腺成熟前期、性腺成熟期、性腺成熟后期3個(gè)時(shí)期各取健康雌、雄斑馬魚各30尾，每10尾為一組，共分3組，取卵巢、精巢兩種組織。為消除個(gè)體差異，將每組中同一組織的混合樣為一個(gè)樣本，放入一個(gè)去RNA酶處理的1.5 mL離心管中并立即放入液氮中，置于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物設(shè)計(jì)以β-actin基因作為內(nèi)參基因。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡKit (Tli RNaseH Plus)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)β-actin基因和CYP11a1基因引物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表1。

表1實(shí)時(shí)熒光定量引物

Tab.1Primers used for expression analysis by Real-time quantitative PCR

引物primer序列sequence(5'-3')CYP11a1-FCTGTAGCAATGAGTCTTCCACYP11a1-RTTCAGTCTCGGCAATCCTβ-actin-FGGCATCACACCTTCTACAAβ-actin-RCAGAGTCCATCACAATACCA

1.2.4總RNA提取及cDNA第一條鏈合成將按“1.2.1”、“1.2.2”節(jié)方法獲得的樣本，參照Trizol?Reagent (Invitrogen, USA)說(shuō)明書提取總RNA。用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以確定RNA的完整性，要求28 S 條帶亮度是18 S條帶的2倍。測(cè)定樣本的OD260 nm和OD280 nm值，以確定RNA的濃度及純度，且保證OD260 nm/OD280 nm值在1.8~2.0之間。

分別從用于斑馬魚成魚CYP11a1基因在4種組織中表達(dá)研究的12個(gè)組織樣本，以及用于斑馬魚成魚CYP11a1基因在3個(gè)性腺不同時(shí)期表達(dá)研究的18個(gè)樣本中，取900 ng樣品RNA進(jìn)行cDNA第一鏈合成，然后根據(jù)試驗(yàn)需求適當(dāng)稀釋作為RT-PCR模板。

1.2.5基因引物特異性的驗(yàn)證通過(guò)其溶解曲線來(lái)判斷實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增特異性。溶解曲線由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)自動(dòng)生成，如果其溶解曲線只有一個(gè)峰則證明為特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，否則為非特異性擴(kuò)增。

1.2.6基因引物擴(kuò)增效率的驗(yàn)證將斑馬魚cDNA原液按照51倍、52倍、53倍、54倍進(jìn)行稀釋，包括原液在內(nèi)共設(shè)置5組，并以水為陰性對(duì)照，分別檢測(cè)β-actin和CYP11a1基因引物的擴(kuò)增效率以及其是否適用于實(shí)時(shí)熒光定量基因表達(dá)分析。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)采用ABI 7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，USA)。PCR反應(yīng)體系(共20 μL)：SYBR Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，用滅菌蒸餾水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性30 s；95 ℃下變性5 s，55 ℃下退火34 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火1 min，95 ℃下延伸15 s。

1.3　數(shù)據(jù)處理

實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)以2-ΔΔCT法處理，表達(dá)量變化以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。為確保實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，每個(gè)樣品均重復(fù)測(cè)定3次。使用SPSS軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2結(jié)果與分析

2.1　 β- actin和 CYP11a1基因引物特異性的驗(yàn)證

溶解曲線由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)自動(dòng)生成(圖1)，其橫坐標(biāo)代表溫度，縱坐標(biāo)代表反應(yīng)過(guò)程中生成的產(chǎn)物量。如圖1所示，斑馬魚β-actin引物溶解曲線在86.88 ℃時(shí)有一峰，CYP11a1引物溶解曲線在85.37 ℃時(shí)有一峰，且無(wú)雜峰，說(shuō)明其特異產(chǎn)物單一，沒有引物二聚體的產(chǎn)生，設(shè)計(jì)的引物適合用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

注：A為β-actin基因引物溶解曲線；B為CYP11a1基因引物溶解曲線 Note:A, melting curve of β-actin gene primer；B, the melting curve of CYP11a1 gene primer 圖1　斑馬魚β-actin和CYP11a1基因引物溶解曲線 Fig.1　Melting curve of β-actin gene primer and CYP11a1 gene primer in zebrafish

2.2　 β- actin與 CYP11a1引物擴(kuò)增效率的鑒定

標(biāo)準(zhǔn)曲線由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)自動(dòng)生成(圖2)，其縱坐標(biāo)為CT值，橫坐標(biāo)代表實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)中的模板量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，

注：A為β-actin基因引物標(biāo)準(zhǔn)曲線；B為CYP11a1基因引物標(biāo)準(zhǔn)曲線 Note:A,standard curve of β-actin gene primer；B,standard curve of CYP11a1 gene primer 圖2　斑馬魚β-actin及CYP11a1基因引物標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.2　Standard curve of β-actin gene primer and CYP11a1 gene primer in zebrafish

得出CT值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02~0.18。結(jié)果表明，β-actin和CYP11a1引物擴(kuò)增效率一致，這表明其可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，可用2-ΔΔCT方法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

2.3　斑馬魚 CYP11a1基因的組織表達(dá)

根據(jù)2-ΔΔCT方法計(jì)算每種組織中的基因表達(dá)量，結(jié)果如圖3 所示。從圖3可見：CYP11a1基因在卵巢、精巢、肌肉和腦4種組織中均有表達(dá)且具有一定的組織差異；在卵巢中表達(dá)量最高(P<0.01)，在腦中表達(dá)量最低(P<0.05)；卵巢中的表達(dá)量為腦中表達(dá)量的204.7倍，精巢中的表達(dá)量為腦中表達(dá)量的38.9倍，肌肉中的表達(dá)量為腦中表達(dá)量的17倍。

注：標(biāo)有不同大寫字母者表示組間有極顯著性差異(P<0.01)，標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05) Note:The means with different capital letters are very significantly different at the 0.01 probability level,means with different letters being significantly different at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences 圖3　斑馬魚CYP11a1基因在4種組織中的表達(dá)量 Fig.3　Relative expression of CYP11a1 gene in different tissues of zebrafish

2.4　斑馬魚 CYP11a1基因在不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

從圖4可見：CYP11a1在3個(gè)卵巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，其在卵巢成熟期的表達(dá)量最低，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，在卵巢成熟前期的表達(dá)量為卵巢成熟期表達(dá)量的1.7倍，在卵巢成熟后期的表達(dá)量為卵巢成熟期表達(dá)量的1.5倍；CYP11a1在3個(gè)精巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，在精巢成熟期表達(dá)量最高(P<0.05)，為精巢成熟前期表達(dá)量的6.5倍，為精巢成熟后期表達(dá)量的13.4倍。

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示精巢組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05) Note:The means with different letters are significant differences at the 0.05 probability level in testis, and the means with the same letters are not significant differences 圖4　斑馬魚CYP11a1基因在不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá) Fig.4　Relative expression of CYP11a1 gene in different developmental phases of gonads in zebrafish

3討論

在對(duì)魚類CYP基因的研究中，已在斑馬魚、美洲魟Dasyatisamericana[10]、日本鰻鱺Anguillajaponica[11]等魚類中獲得CYP11基因。Hsu等[12]研究顯示，脊椎動(dòng)物CYP11a基因編碼的膽固醇側(cè)鏈裂解酶可將膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，而且源于母體的CYP11a mRNA與在斑馬魚受精卵細(xì)胞遷移過(guò)程中起重要作用的孕烯醇酮的產(chǎn)生有關(guān)。斑馬魚CYP11a基因敲除后可導(dǎo)致發(fā)育軸縮短以及外包缺陷[3]。這些研究表明，CYP11a基因在斑馬魚早期發(fā)育具有重要作用。

研究表明，膽固醇側(cè)鏈裂解酶在類固醇生成組織中高度表達(dá)，最明顯的組織為腎上腺皮質(zhì)、卵巢、精巢和胎盤，并且其位于線粒體內(nèi)膜[11,13-14]。斑馬魚從胚胎發(fā)育開始，CYP11a1基因就在卵黃合胞體層表達(dá)，隨后在胚胎期腎原基表達(dá)，在成體腎間腺體表達(dá)[12,15-16]。Hsu等[12]進(jìn)行的RT-PCR和整體雜交清楚地表明，CYP11a1基因在斑馬魚腦的不同部位轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如端腦和下丘腦等。最近對(duì)斑馬魚腦的研究表明，CYP11a1基因在前腦，從嗅覺突觸橫跨到更邊緣的區(qū)域(如小腦)廣泛表達(dá)，CYP11a1基因轉(zhuǎn)錄在大腦皮層下部、下丘腦中前部、視覺上皮層顯著表達(dá)[17]。在斑馬魚成魚中，CYP11a1基因編碼的mRNA在性腺、腎和腦中均有表達(dá)[15-16]。這與本研究中CYP11a1基因在卵巢、精巢和腦中均有表達(dá)相一致。本研究中，CYP11a1在卵巢中的表達(dá)量高于精巢，在腦中表達(dá)量最低。

本研究中，采用實(shí)時(shí)熒光定量法研究CYP11a1基因在不同性腺發(fā)育時(shí)期表達(dá)時(shí)，CYP11a1基因在3個(gè)卵巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，其在卵巢成熟期的表達(dá)量最低，在卵巢成熟前期的表達(dá)量是卵巢成熟期表達(dá)量的1.7倍，在卵巢成熟后期的表達(dá)量是卵巢成熟期表達(dá)量的1.5倍；CYP11a1基因在3個(gè)精巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)則表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，在精巢成熟期表達(dá)量最高，分別為精巢成熟前期、精巢成熟后期表達(dá)量的6.5倍、13.4倍。由此可以推斷，CYP11a1基因表達(dá)在一定程度上與斑馬魚性腺(卵巢、精巢)相關(guān)，其可能在促進(jìn)斑馬魚精子成熟中發(fā)揮一定作用。

本研究中，研究了斑馬魚CYP11a1基因在不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，性腺發(fā)育分期較少，今后要更系統(tǒng)地將性腺發(fā)育按照硬骨魚類性腺發(fā)育分期分為6個(gè)時(shí)期：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期和Ⅵ期[18]，對(duì)試驗(yàn)做進(jìn)一步改進(jìn)，對(duì)斑馬魚CYP11a1基因在不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行更加系統(tǒng)和準(zhǔn)確的研究。

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2.搞好消毒工作。臨產(chǎn)前2～3 d要將產(chǎn)圈打掃干凈，臨產(chǎn)當(dāng)天把母豬乳房和胸、腹部清洗干凈，用0.01%高錳酸鉀溶液或0.1%新潔爾滅涂抹消毒，以后每10～15 d用消毒藥進(jìn)行1次消毒。仔豬出生后，可以用50%北里霉素涂抹母豬乳頭，每日2次，此法能有效預(yù)防仔豬黃痢。對(duì)于斷奶仔豬，可以在飼料中加入利高霉素或新霉素，每千克飼料添加100 g，連續(xù)7 d，可預(yù)防下痢。

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Expression ofCYP11a1 in different developmental phases of

gonad in zebrafishDaniorerio

CHEN Xiao-hong, QIU Xue-mei, HAO Wei-wei, WANG Xiu-li

(Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Key words：Daniorerio;CYP11a1 gene; gonadal development