李建省，王寶蕊

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050

腎間質(zhì)纖維化（RIF）是幾乎所有慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎臟病的最后共同通路。RIF主要病理改變?yōu)榇罅砍衫w維細胞及肌成纖維細胞增生，細胞外基質(zhì)產(chǎn)生和堆積導致腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化，最終導致腎功能衰竭。目前，針對腎間質(zhì)纖維主要采取抑制或清除促纖維化因子方法，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的關鍵因子。目前所知smads蛋白是TGF-β受體唯一的胞內(nèi)信號傳導，TGF-β/smad信號傳導通路是RIF主要的最終共同通路。因此，阻斷腎間質(zhì)纖維化某些關節(jié)環(huán)節(jié)，可能阻止腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展從而達到治療慢性腎臟病治療目的。在前期的臨床研究中我們發(fā)現(xiàn)溫腎活血化濕方具有改善腎功能，降低尿蛋白，延緩慢性腎功能衰竭的功效。本研究利用UUO法復制腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，觀察溫腎活血化濕方對其腎組織結(jié)構(gòu)及 TGF-β1，smad7蛋白表達的影響，初步探討其對該模型大鼠腎組織TGF-β/smad信號傳導通路的影響及其防治腎間質(zhì)纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 氯沙坦（杭州默沙東公司生產(chǎn)，國藥準字：J20B0148）。TGF-β1，smad7(兔抗大鼠多克隆抗體)、免疫組化二抗及DAB試劑盒（武漢博士德）。溫腎活血化濕方（藥物組成：黃芪30 g，川芎10 g，續(xù)斷10g，牛膝10g，菟絲子30g，桂枝30g，白豆蔻10 g）。

1.2 動物分組及給藥 清潔級3～4周齡雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量180～210 g，蘭州大學醫(yī)學院動物中心提供，醫(yī)學動物合格證號 SCXK（甘）2009-0004，參照文獻[1]方法采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(UUO法)建立腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，隨機分為假手術組、UUO組、溫腎活血化濕方組、氯沙坦組，每組20只。以5%水合氯醛腹腔注射麻醉，從右側(cè)旁正中切口剪開腹壁，暴露右側(cè)輸尿管，結(jié)扎右側(cè)輸尿管，關閉腹腔。假手術組只分離但不結(jié)扎輸尿管。術后第2天給藥，假手術組、UUO組給予相應生理鹽水，氯沙坦組灌胃給予氯沙坦（10mg·kg-1·d-1）混懸液，溫腎活血化濕方組給予溫腎活血化濕方（我院制劑室經(jīng)水煮提取，含生藥2 g/mL，按換算系數(shù)換算成大鼠灌胃給藥）水煎液(9.8 g·kg-1·d-1)。術后第 7、14、21天每組處死10只大鼠，切除右腎，腎組織部分行甲醛固定、脫水后包埋備用，其余液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標

1.3.1 考馬斯亮藍法測定尿蛋白定量 第7、14、21天分別用代謝籠收集大鼠24小時尿液，用考馬斯亮藍法測定24小時尿總蛋白定量。

1.3.2 腎組織病理檢測 取右側(cè)腎組織切片，進行蘇木素-伊紅（HE）、Masson染色，在光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化情況

1.3.3 腎組織TGF-β1、smad7蛋白表達 按照兩步法免疫組化檢測試劑盒(HRP-多聚體抗兔)操作步驟進行，PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素輕度復染，光鏡下觀察腎組織TGF-β1、smad7蛋白的表達。光鏡下細胞核、細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件半定量分析免疫組化圖片。根據(jù)累計吸光度（A）與面積之比值，選取10個不重疊視野，計算單位面積陽性染色區(qū)域的平均A進行統(tǒng)計學分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用(χ±s)表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 24小時尿總蛋白定量 與模型組相比較，造模后第14天溫腎活血化濕方尿蛋白定量明顯降低（P＜0.05）,第21天溫腎活血化濕方與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 各組大鼠24小時尿總蛋白定量(χ±s)mg/24h

2.2 大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達 與模型組比較，假手術組大鼠在第7、14、21天腎小管上皮細胞胞漿中TGF-β1蛋白表達增多（P＜0.05），溫腎活血化濕方組、纈沙坦組與模型組相比較TGF-β1蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見表2。

2.3 大鼠腎組織smad7蛋白表達 與模型組比較，假手術組大鼠在第7、14、21天腎組織smad7蛋白表達升高（P＜0.05），溫腎活血化濕方組、氯沙坦組與模型組相比較smad7蛋白表達明顯增加（P＜0.05）。見表3。

表2 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達的比較(χ±s)

表3 各組大鼠腎組織smad7蛋白表達的比較(χ±s)

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病最終的共同通路。TGF-β1誘導肌成纖維細胞激活并導致細胞外基質(zhì)生成，進而導致腎纖維化和腎小管萎縮[2]。因此，抑制TGF-β1誘導的肌成纖維細胞活化是抑制腎間質(zhì)纖維化的治療策略。目前，腎間質(zhì)纖維化動物模型有UUO、5/6腎切除(subtotal nephrectomy，STNx)、環(huán)孢素A腎病等多種模型。UUO模型是研究腎小管間質(zhì)纖維化公認的模型。輸尿管結(jié)扎導致腎間質(zhì)纖維化，引起腎臟彌漫性損害[3-4]。

腎間質(zhì)纖維化屬于中醫(yī)學“關格”“溺毒”“水腫”“虛損”等范疇。劉玉寧認為“虛、痰（濁）、瘀、毒”是導致腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展之關鍵。樊均明以“腎痿”立論。王獻耀教授提出“腎絡微型癥瘕”是腎纖維化的中醫(yī)病機[5]。益氣活血化濁、補腎活血、溫陽法為其治療大法[6]。我們認為虛、瘀、痰濕是導致慢性腎臟病腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展之關鍵。腎虛為本，痰（濁）、瘀為標，毒是加重腎間質(zhì)纖維化不可忽視的方面。在慢性腎臟病4～5期，以脾腎陽虛為主，我們認為腎陽虛腎絡瘀阻為腎間質(zhì)纖維化主要病機，因此我們用溫腎活血化濕法治療慢性腎臟病臨床效果滿意。溫腎活血化濕方由黃芪、川芎、紅花、續(xù)斷、牛膝、菟絲子、淫羊藿、桂枝、干姜、白豆蔻、白芷組成，具有溫腎活血，健脾化濕之功效，為治療慢性腎臟病有效方劑。已有研究證實，黃芪、川芎能調(diào)節(jié)細胞免疫及體液免疫，降低尿蛋白，保護腎功能。通過下調(diào)TGF-β表達，抑制腎小管轉(zhuǎn)分化、下調(diào)ECM的主要成分、下調(diào)CTGF表達等多途徑多靶點抑制腎小管上皮細胞增殖，抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，改善腎間質(zhì)纖維化[7]。補腎益氣法能抑制成纖維細胞過度活化，促進其凋亡[8]。補腎活血中藥可以加速細胞外基質(zhì)降解，減少細胞外基質(zhì)積聚，從而防治腎小球硬化[9]。益氣活血方通過下調(diào)TGF-β、上調(diào)smad7的表達來遏制腎纖維化的進展[10]。

本研究結(jié)果表明，溫腎活血化濕方具有降低模型大鼠尿蛋白作用，通過減少TGF-β1表達，上調(diào)smad7蛋白表達，減輕腎間質(zhì)纖維化，為進一步研究該治法及其方藥提供實驗依據(jù)。

[1]Yang J,Liu Y.Blockage of tubular epithelial to myofibroblast transition by hepatocyte growth factor prevents renal interstitial f ibrosis[J].J Am SocN-ephrol,2002,13(1):96-107.

[2]Meran S,Steadman R.Fibroblasts and myof ibroblasts in renal fibrosis[J].Int JExp Pathol,2011,92(158)：67.

[3] 趙宗江，仇琪.核轉(zhuǎn)錄因子κB在腎間質(zhì)纖維化中的作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2006,7（10）:610-612.

[4]Subash C Gupta,Chit ra Sundaram,Simone Reuter,et al.Inhibiting NF-κB Activation by Smal l Molecules As a Therapeutic St rategy Biochim Biophys Acta[J].2010，179(10-12):775-787.

[5] 劉尚建，孫衛(wèi)衛(wèi)，崔謹，等.和解聚散方對UUO模型大鼠腎組織NF-κB表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2013，14（1）：62-63.

[6] 武士鋒,趙菁莉,楊洪濤.楊洪濤教授運用附子溫陽治療慢性腎臟病的經(jīng)驗[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2009,10(11):945-947．

[7] 張瑞芳,萬建新,許艷芳.中藥抗腎小管上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的研究進展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2011,12(4):368-370.

[8] 沈燁渠,何立群.補腎益氣法防治腎間質(zhì)纖維化機制研究概況[J].中醫(yī)雜志,2010,51（5）:468-470.

[9] 王麗敏,張勉之,張艷秋.補腎活血法對腎小球系膜細胞MMP-2及TIMP-2表達的影響[J].廣東醫(yī)學,2010,31(9):1092-1094.

[10]劉詠梅,劉瑞華,劉文軍,等.益氣活血方對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎臟TGF-β/smad信號通路及結(jié)締組織生長因子的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學報,2010,8(12):1165-1173.