*基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012A034)。

16S rDNA-RFLP分析不同產(chǎn)地人參內(nèi)生菌的多態(tài)性*

*基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012A034)。

★萬紅嬌謝燕飛謝斌朱金華馬廣強(qiáng)*(江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院南昌 330004)

摘要：目的：采用16S rDNA—RFLP方法分析比較不同產(chǎn)地、品種人參內(nèi)生菌的差異，為探討人參內(nèi)生菌對其藥材的影響奠定基礎(chǔ)。方法：收集不同產(chǎn)地、不同品種人參，用細(xì)菌基因提取試劑盒提取人參內(nèi)生菌基因組，擴(kuò)增內(nèi)生菌16S rDNA片段后，用RFLP(限制性酶切片段分析)方法分析不同產(chǎn)地、不同品種人參內(nèi)生菌的多態(tài)性。結(jié)果：不同產(chǎn)地、不同品種人參均含有內(nèi)生細(xì)菌，且內(nèi)生細(xì)菌菌種組成有明顯差異。結(jié)論：不同產(chǎn)地的人參有不同的人參內(nèi)生菌，通過鑒定內(nèi)生菌可鑒定人參的產(chǎn)地。

關(guān)鍵詞：人參；16S rDNA；RFLP；內(nèi)生菌

植物內(nèi)生菌(endophyte) 是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部、不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物。植物內(nèi)生菌包括內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌(內(nèi)生細(xì)菌包括內(nèi)生放線菌) ,可從經(jīng)過嚴(yán)格表面消毒的植物組織或植物組織內(nèi)部分離得到[1]。內(nèi)生菌在植物體內(nèi)廣泛存在,大量研究表明，一方面，植物內(nèi)生菌的組成與植物生長的產(chǎn)地環(huán)境具有密切相關(guān)性，在一定的生境下，植物根部的內(nèi)生菌較為穩(wěn)定；另一方面，內(nèi)生菌與寄主植物的生長和生理往往具有密切的關(guān)系，無疑會(huì)對寄主植物的特性產(chǎn)生影響。因而植物內(nèi)生菌對藥用植物的生長、藥材質(zhì)量的影響從20世紀(jì)90年代起逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[2]。而，限制性酶切片段分析(RFLP)作為一種生物研究方法，已廣泛應(yīng)用于基因的多態(tài)性分析和不同環(huán)境中微生物菌的多態(tài)性分析[7-10]。人參(Panax ginseng)由于其生產(chǎn)資源有限、生產(chǎn)周期長、成本高、價(jià)格昂貴，故市場上以次充好，以假亂真的現(xiàn)象很多[3-4]，藥材經(jīng)營商家、制藥企業(yè)及社會(huì)公眾對人參的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別有著普遍的需求。作為中藥材傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，需要豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn)[4]，現(xiàn)代的利用HPLC、GC等手段的化學(xué)成分鑒別方法[5-6]，則對儀器設(shè)備有較高的要求，在應(yīng)用上有一定的局限性。作為以根入藥的人參，開展其內(nèi)生菌的研究對于人參的鑒別和質(zhì)量控制無疑具有重要的意義。為此，本實(shí)驗(yàn)采用PCR擴(kuò)增16S rDNA，RFLP分子標(biāo)記方法對不同產(chǎn)地、品種人參內(nèi)生細(xì)菌的多態(tài)性、特定產(chǎn)區(qū)和品種人參特有的RFLP片段，對不同產(chǎn)地、品種的人參內(nèi)生細(xì)菌的多樣性進(jìn)行分析,初步研究植物內(nèi)生菌在道地藥材藥性形成過程中的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料各種人參(美國野生西洋參，美國許氏種植西洋參，吉林種植西洋參，加拿大種植西洋參，西洋參)以及不同種類的參類(白參，南沙參，北沙參，黨參，丹參)(均購自南昌市黃慶仁棧橋大藥房)；胡蘿卜(購于菜市場)。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，普通DNA產(chǎn)物膠純化試劑盒(購自天根生化科技有限公司)；限制性內(nèi)切酶Hha I，Rsa I ,Hinf I(Promaga)，2×Taq PCRMasterMix(天根生化科技有限公司)，擴(kuò)增引物為通用引物UFPL (5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3') ，URPL (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，擴(kuò)增長度為1484 bp(上海生物工程有限公司合成)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人參的處理將人參3 g用無菌水洗凈后，置于99%乙醇 溶液中浸泡1 min，然后置于3.125%的次氯酸鈉溶液中浸泡6min，再置于99%乙醇溶液中浸泡30 s，最后用無菌水沖洗5次。樣品用無菌吸水紙吸干后備用。吸取50 μL最后一次洗滌水涂布在NA平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，作為空白對照組。將處理過的樣品剪碎，取1 g置于含10 mL無菌水的試管中，28 ℃條件培養(yǎng)2～3d。

1.2.2植物內(nèi)生菌總DNA的提取取細(xì)菌培養(yǎng)液，搖勻后取1.5 mL于無菌離心管中離心(10000 r/min，4 ℃)2 min 后，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。

1.2.3植物內(nèi)生菌16S rDNA的擴(kuò)增及檢測 擴(kuò)增體系為20 μL，其中引物各1 μL，2×Taq PCRMasterMix 10 μL，DNA模板4 μL，雙蒸水4 μL。擴(kuò)增條件為95℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.5 min，共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4限制性內(nèi)切酶酶切分別用限制性內(nèi)切酶Hha I，Rsa I , Hinf I對16S rDNA產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定。酶切體系為雙蒸水12.3 μL，C Buffer 2 μL，BSA 0.5 μL，內(nèi)切酶0.5 μL，DNA，5 μL，共20 μL體系。

2結(jié)果

2.116S rDNA -PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果如圖1所示：結(jié)果表明西洋參內(nèi)生菌中均能檢測到細(xì)菌的16S rDNA，證明人參中存在有內(nèi)生細(xì)菌。

1.DL15000；2.美國野生西洋參；3.美國許氏種植西洋參；4.吉林種植西洋參；5.加拿大種植西洋參；6.長春種植西洋參；7.不知產(chǎn)地西洋參；8.空白對照

圖116S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

2.2RFLP鑒定不同產(chǎn)地西洋參內(nèi)生細(xì)菌的差異2.2.1不同產(chǎn)地西洋參Hha I酶切鑒定不同西洋參內(nèi)生菌的總16S rDNA Hha I酶切結(jié)果(圖2)顯示，不同產(chǎn)地西洋參的16S rDNA-RFLP條帶有部分相同；但是美國野生西洋參/許氏種植西洋參/吉林種植西洋參/加拿大種植西洋參和長春種植西洋參的酶切條帶明顯不同。

1.DL2000；2.美國野生西洋參；3.美國許氏種植西洋參；4.吉林種植西洋參；5.加拿大種植西洋參；6.長春種植西洋參；7.不知產(chǎn)地西洋參

圖2不同西洋參內(nèi)生菌總16S rDNA Hha I酶切結(jié)果

2.2.2不同產(chǎn)地西洋參RsaI酶切鑒定不同西洋參內(nèi)生菌的總16S rDNARsa I酶切結(jié)果(圖3)，其中美國野生西洋參/許氏種植西洋參/吉林種植西洋參/加拿大種植西洋參和長春種植西洋參的酶切條帶存在顯著差異，幾乎無共有條帶。

1.DL2000；2.美國野生西洋參；3.美國許氏種植西洋參；4.吉林種植西洋參；5.加拿大種植西洋參；6.長春種植西洋參；

圖3不同西洋參內(nèi)生菌總16S rDNARsa I酶切結(jié)果

2.2.3不同產(chǎn)地西洋參Hinf I酶切鑒定不同產(chǎn)地西洋參內(nèi)生菌的總16S rDNA Hinf I酶切結(jié)果(圖4)表明，其中美國野生西洋參/許氏種植西洋參/吉林種植西洋參/加拿大種植西洋參和長春種植西洋參的酶切條帶明顯不同。Hinf I限制性內(nèi)切酶酶切16S rDNA帯型豐富。

1.DL2000；2.美國野生西洋參；3.美國許氏種植西洋參；4.吉林種植西洋參；5.加拿大種植西洋參；6.長春種植西洋參；7.不知產(chǎn)地西洋參

圖4不同西洋參內(nèi)生菌總16S rDNA Hinf I酶切結(jié)果

2.3酶切鑒定不同人參種類內(nèi)生細(xì)菌的差異

2.3.1不同人參種類Hha I酶切鑒定不同人參內(nèi)生菌的總16S rDNA Hha I酶切結(jié)果(圖5)。其中西洋參/白參/沙參/黨參/胡蘿卜/丹參的酶切條帶明顯不同。沙參和胡蘿卜內(nèi)生菌16S rDNA被完全切成小片段。

2.3.2不同人參種類Rsa I酶切鑒定不同人參內(nèi)生菌的總16S rDNARsa I酶切結(jié)果(圖6)。其中西洋參/白參/黨參/丹參的酶切條帶明顯不同。沙參和胡蘿卜內(nèi)生菌16S rDNA完全被降解。

2.2.3不同人參種類Hinf I酶切鑒定不同人參內(nèi)生菌的總16S rDNA Hinf I酶切結(jié)果(圖7)，其中西洋參/白參/黨參/丹參的酶切條帶明顯不同。沙參和胡蘿卜內(nèi)生菌16S rDNA被完全降解。

1.DL2000；2.西洋參；3.白參；4.沙參；5.黨參；6.胡蘿卜；7.丹參

圖5不同人參內(nèi)生菌總16S rDNA Hha I酶切結(jié)果

1.DL2000；2.西洋參；3.白參；4.沙參；5.黨參；6.胡蘿卜；7.丹參

圖6不同人參內(nèi)生菌總16S rDNA Rsa I酶切結(jié)果

1.DL2000；2.西洋參；3.白參；4.沙參；5.黨參；6.胡蘿卜；7.丹參

圖7不同人參內(nèi)生菌總16S rDNA Hinf I酶切結(jié)果

3討論

近年來，研究者已從紅豆杉、桃兒七、雷公藤、長春花、青蒿、薄荷、杜仲和美登木等多種藥用植物分離到了大量內(nèi)生菌。藥用植物內(nèi)生菌與宿主植物之間存在復(fù)雜的微生態(tài)關(guān)系。兩者互相進(jìn)行物質(zhì)、能量及基因交流，在長期進(jìn)化過程中形成了互惠共生關(guān)系[1-11]。對于生長在不同生境中的中藥材，由于所處生態(tài)環(huán)境的差異以及藥材原植物自身所產(chǎn)生的遺傳變異(居群、品系或品種)，其結(jié)果可能導(dǎo)致內(nèi)生菌種群結(jié)構(gòu)在道地藥材與非道地藥材之間存在較大差異。由于不同內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類一般不同，因此這種種群結(jié)構(gòu)的差異會(huì)產(chǎn)生功能多樣性，不同的內(nèi)生菌種群以各自不同的方式影響著藥材性狀、生長以及有效成分的積累等，最終導(dǎo)致道地藥材與非道地藥材品質(zhì)的差異[1-2,11-13]。

本實(shí)驗(yàn)通過16S rDNA PCR方法擴(kuò)增人參植物內(nèi)生細(xì)菌基因，不同產(chǎn)區(qū)、不同品種的人參都擴(kuò)增出16S rDNA 片段，說明植物內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于不同品種人參內(nèi)。通過對16S rDNA PCR產(chǎn)物RFLP分析發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地、不同品種的人參的植物內(nèi)生菌的種類有明顯差異，不同產(chǎn)地的同種植物的內(nèi)生菌也有很大的差異性。提示，人參內(nèi)生菌的特征條帶可能具有人參產(chǎn)地和品種的鑒別價(jià)值，可應(yīng)用于建立人參簡便、快速的微生物學(xué)鑒定方法；同時(shí)，進(jìn)一步結(jié)合對不同產(chǎn)地、品種人參的質(zhì)量評價(jià)分析，探討其質(zhì)量與內(nèi)生菌特征條帶的相關(guān)性，可為人參生產(chǎn)區(qū)劃、質(zhì)量控制提供新的科學(xué)依據(jù)。

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Analysis the Differences of Endophyte Bacterias in Panxiginsengs by 16S rDNA -RFLP Method

WAN Hong-jiao， XIE Yan-fei，XIE Bin ，ZHU Jin-hua ，MA Guang-qiang

JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicnie,Nanchang330004,China;

Abstract:Objective:In this study, method of 16S Rdna-RFLP were used to detect the differences of the endophyte in Panxginseng. Methods: PCR were used to amplify the 16S rDNA of endophyte bacterias in Panxginseng, then the products of PCR were digested by single enzyme. Results: there Were obvious differences in the endophyte bacterias in different kinds of Panxginsengs. Conclusion: It is possible to identify the producing region of Panxginsengs by detecting the special bacterias in its endophte．

Key words:Panxginseng; 16S rDNA; RFLP;Endophyte

收稿日期：(2014-10-13)編輯：曾文雪

中圖分類號(hào)：Q93

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

通信作者：*馬廣強(qiáng)(1977—)，男，博士。研究方向:病原微生物學(xué)。Tel：1877005061，E-mail：maguangqiang@163.com.。