何玲玲，韋國兵，胡奇軍

（江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西 南昌 330004）

·論著·

高效液相色譜法測定銀黃口服液中黃芩苷含量及不確定度分析

何玲玲，韋國兵，胡奇軍

（江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西 南昌 330004）

目的建立銀黃口服液中黃芩苷的定量測定方法，并對所建立方法進行不確定度評價。方法采用高效液相色譜（HPLC）法測定銀黃口服液中黃芩苷含量，再根據(jù)方法學驗證數(shù)據(jù)，對測定過程中引入的不確定度進行評估，由此計算合成不確定度，最終給出測量結(jié)果在95%置信區(qū)間下的擴展不確定度。結(jié)果采用本方法測定銀黃口服液中黃芩苷的擴展不確定度為2.40%。結(jié)論建立的黃芩苷HPLC定量測定方法，結(jié)果準確且重現(xiàn)性好；建立的不確定度評定適用于HPLC法測定藥物中有效成分的不確定度分析。

銀黃口服液；黃芩苷；HPLC；不確定度

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之間的分散性與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)系的參數(shù)，是被測量客觀值在某一量值范圍內(nèi)的一個評定，其大小決定了測量結(jié)果的實用價值[1]。不確定度越小，測量結(jié)果的質(zhì)量越高，實用價值越大?！稒z測和校準實驗室能力的通用要求》規(guī)定，檢測和校準實驗室都必須有對測量結(jié)果進行不確定度評定的程序，以對實驗測量結(jié)果的可信度進行評定。目前，測量不確定度的理論已在國家計量基準、標準物質(zhì)的研究及儀器校準、化工生產(chǎn)和產(chǎn)品檢驗等領(lǐng)域得到大力的推廣應(yīng)用，因此正確表達和評定測量方法的測量不確定度正逐步成為國際通行的要求[2]。

當前國內(nèi)很多學者對銀黃口服液中的黃芩苷開展了含量測定[3-5]，但很少對其開展不確定度分析。本文根據(jù)《測量不確定度評定與表示》[6]（JJF1059-1999）中有關(guān)規(guī)定對高效液相色譜法測定銀黃口服液中黃芩苷含量的不確定度進行分析，找出影響其不確定度的因素并對各分量進行評估，最終給出測量結(jié)果的置信區(qū)間和置信水平，以期加強對含量測定的數(shù)據(jù)分析和測量結(jié)果的準確性和可信度的認識。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司），G1314B紫外檢測器，GZX-9070 MBE恒溫箱，色譜柱Kromasil 100-5C18ODS2（5μm，250 mm×4.6 mm，瑞典Kromasil公司），AB104-N電子天平（瑞士METTER公司）；KQ-100型超聲波清洗機（江蘇昆山超聲儀器有限公司）。

金銀花、黃芩藥材均購自江西省樟樹市藥材市場，黃芩苷購自中國藥品生物檢定所（質(zhì)量分數(shù)>98%，批號：110715-201016），甲醇為色譜純，其他為分析純；水為雙蒸餾水。

1.2 銀黃口服液制備

取黃芩和金銀花，參照《中國藥典，2010版》（一部）[7]進行提取，分別得黃芩提取物和金銀花提取物；將黃芩提取物加水適量使之溶解，用8%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0，過濾，濾液與金銀花提取物合并，用質(zhì)量分數(shù)為8%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到7.2，煮沸1 h，過濾，加入單糖漿適量，加水至全量，搖勻，用質(zhì)量分數(shù)為8%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到7.2，加水至1 000 ml，濾過，滅菌即得銀黃口服液樣品。

1.3 色譜條件

色譜柱Kromasil 100-5C18ODS2（5μm，250 mm× 4.6 mm）。流動相：甲醇-水-磷酸（45.0∶55.0∶0.2）。檢測波長：280 nm；柱溫：室溫；流速：1 ml/min；理論塔板數(shù)按黃芩苷的色譜峰計算不少于2 200。

1.4 溶液制備

1.4.1 對照品溶液的制備精密稱取干燥的黃芩苷對照品6.8 mg于25 ml的容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20 min，搖勻，定容至刻度，即得到濃度為0.272 mg/mL的對照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備精密吸取銀黃口服液2.0 ml置于25 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲30 min，搖勻過濾，定容至刻度，即得供試品溶液。

1.4.3 陰性樣品溶液的制備取金銀花按照《中國藥典》（2010版，一部）[7]制備工藝制備成相應(yīng)的陰性樣品溶液。

1.5 方法學考察

1.5.1 線性關(guān)系考察精密吸取0.272 mg/ml的黃芩苷對照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、3.0和4.0 ml分別置于10.0 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得到0.00544、0.01088、0.0272、0.0544、0.0816及0.1088 mg/ml的對照品溶液。分別取以上6種對照品溶液各進樣10μl，記錄色譜圖色譜峰面積，以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標作線性回歸，回歸方程為：Y=5835.5x-79.640，r=0.9992，表明黃芩苷進樣量在0.0000544 mg～0.001088 mg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.5.2 精密度試驗取濃度為0.272 mg/ml的對照品溶液，精密吸取對照品溶液10μl，連續(xù)進樣6次，按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算得黃芩苷峰面積的RSD為0.91%。

1.5.3 穩(wěn)定性試驗取配制好的同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12和24 h進樣各10μl，按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算RSD值，RSD為1.2%，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，可以用于樣品的重復(fù)測定。

1.5.4 重復(fù)性試驗取同一批號銀黃口服液樣品（批號：140608）6份，精密吸取，按上述方法進行測定，測得黃芩苷含量為0.09449 mg/ml，RSD為1.3%。1.5.5回收率試驗取同一批號銀黃口服液樣品（批號：140710）6份，再分別用移液管精密移取1 ml溶液于3只10 ml容量瓶中，進行編號。再分別用移液管量取對照品溶液（0.272 mg/ml）相當于供試品溶液質(zhì)量的80%、100%及120%于上述3個容量瓶中，搖勻，按樣品溶液制備項下操作，進樣、記錄色譜峰面積并計算回收率。見表1。

1.6 樣品測定

精密量取對照品與樣品溶液（批號：140608、140609及140610）各10μl，注入液相色譜儀，按上述方法測定，按照外標法根據(jù)峰面積計算樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

表1 回收率試驗結(jié)果

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

2 不確定度評定

2.1 不確定度來源分析

不確定度分量主要來源于測量過程中樣品與對照品的質(zhì)量不確定度、體積引入的不確定度、樣品回收率影響引入的不確定度、液相測試過程隨機效應(yīng)帶來的不確定度。采用重復(fù)性研究數(shù)據(jù)及實驗準確度的回收率試驗數(shù)據(jù)，將涵蓋所有樣品制備與檢測過程中隨機效應(yīng)及儀器操作、樣品基質(zhì)等因素的系統(tǒng)誤差所引起的不確定度進行評定。

2.2 不確定度分量量化

2.2.1 試驗方法精密度相對標準不確定度測定根據(jù)試驗方法學對重復(fù)性試驗數(shù)據(jù)進行驗證，采用公式（1）對測定方法中精密度不確定度進行評定。

u（p）/p為相對標準不確定度，RSDi為樣本i的相對標準偏差，ni為樣本i的重復(fù)測定次數(shù)

2.2.2 試驗方法準確度相對標準不確定度測定u（Rm）/（Rm）試驗方法準確度是通過加樣回收率試驗測定的，回收率不確定度按照公式（2）評定。

回收率試驗中對照品溶液的配制是采用的是十萬分之一電子天平精密稱量對照品12.9 mg定容于10 ml容量瓶中，采用2 ml移液管分別吸取0.8，1.0，1.2 ml加至樣品溶液中，所有引入的不確定度u（mspike）/（mspike）包括對照品稱量u（m）、對照品溶液配制u（V1）與對照品溶液的移取u（V2）共3部分所引入的不確定度。

電子天平稱量允許的誤差為±0.1 mg，對允許誤差采用矩形分布計算示值不確定度，對標準偏差采用正態(tài)分布的計算稱量重復(fù)性不確定度。國家計量檢定規(guī)程規(guī)定2 ml單標移液管、10 ml量瓶的容量允許誤差分別為0.01及0.02 ml，樣品稀釋過程中校準不確定度及量器允差按三角分布計算，采用試驗中各規(guī)格量器重復(fù)吸取各標稱容量蒸餾水共6次，以質(zhì)量所得出的標準偏差，按正態(tài)分布計算其不確定度，對照品溶液配制的相對不確定度評定結(jié)果見表3。

2.2.3 計算對照品加入量的相對標準不確定度為

試驗方法準確度不確定度u（Rm）根據(jù)公式2評定，結(jié)果Rm=99，97%，mobs=1.2896mg，量取對照品溶液相當于供試品溶液質(zhì)量的80%、100%及120%進行3組試驗，每組試驗的方差分別為S1=0.0089 mg、S2=0.0028 mg、S3=0.0137 mg，所以合并方差Sp=0.0096 mg，u（mspike）/（mspike）=0.0077，u（Rm）/（Rm）=0.0081。

2.2.4 計算合成不確定度由上述各不確定度分量合成銀黃口服液中黃芩苷定量相對不確定度為[8]：

2.2.5 擴展不確定度及報告不確定度95%置信概率下取包含因子k=2，則相對擴展不確定度U95（W）=k×U=0.0240=2.40%。由實驗所測銀黃口服液中黃芩苷的含量W=0.09449 mg/ml，故其擴展不確定度為：U95=0.009449×0.0240=0.00023 mg/ml，本次實驗所測銀黃口服液中黃芩苷的含量為：W=（0.09449±0.00023）mg/ml。

表3 對照品溶液配制的相對不確定度

3 討論

選取銀黃口服液為研究對象，建立其有效成分黃芩苷的含量測定方法，根據(jù)不確定度理論對回收率試驗及方法重復(fù)性不確定度評定，并于95%可信空間下得出該法測定含量結(jié)果擴展的不確定度為（W×2.40%）mg/ml，對試驗方法可信度進行定量描述，可作為銀黃口服液中測定黃芩苷含量方法學驗證的補充[9]。

本實驗不確定度分析中，從不確定度量化及表3對照品溶液配制的不確定可以看出，本方法測定黃芩苷結(jié)果各分量的不確定度均較小，而測量銀黃口服液中黃芩苷結(jié)果的不確定度主要來自測量過程中樣品與對照品的質(zhì)量不確定度、對照品溶液配制的不確定度、樣品回收率影響引入的不確定度等，其中影響最大的來自對照品溶液配制的不確定度[10]。因此在本實驗操作中為減小操作過程中因?qū)嶒灢僮髡呤炀毘潭犬a(chǎn)生的不確定度，在實驗操作過程中還需增強操作者的實驗操作熟練程度，并盡量避免小容量體積溶液的配制、量取、定容，從而減少因?qū)嶒灢僮饕氲牟淮_定度。同時在數(shù)據(jù)分析中采用方差分析以進一步判斷不確定度分析中一個獨立變量是否受到一個或多個變量因素的影響，從而判斷結(jié)果不確定度是一個因素的作用還是多個因素的交互作用，從而較真實的反映實驗操作過程對結(jié)果的影響，并避免復(fù)雜實驗操作中對各個實驗操作開展不確定度的分析，從而減少不確定度分析的工作量，以達到對各分量進行快速準確的不確定度分析的評估目的。

在藥物分析檢測評定不確定度時，應(yīng)盡可能的分析產(chǎn)生不確定度的所有可能來源。目前，分析測試領(lǐng)域中多采用對每個測定步驟的分析以得出測定結(jié)果的不確定度。但由于化學分析操作相對較復(fù)雜，需附加試驗后再進行B類不確定度的評定，而且其測定過程中對A類不確定度也較難評定，本實驗通過實驗室內(nèi)部方法學驗證法的數(shù)據(jù)進行評定，通過采用方法學考察的準確度與精密度試驗，整體考察檢測方法的不確定度，為實際生產(chǎn)中藥物分析提供參考。

[1]國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.測量不確定度評定與表示指南[M].北京:中國計量出版社,1999:34-42.

[2]中國國家標準化管理委員會.檢測和校準實驗室能力的通用要求(GB/T27025-2008)[S].北京:中國標準出版社,2008:1-6.

[3]朱嘯風,孫欽美,劉景俊.銀黃口服液中黃芩苷和綠原酸含量的測定[J].齊魯藥事,2004,23(6):25-26.

[4]桑旭峰,吳海雯,徐奇超.HPLC同時測定銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷含量[J].中成藥,2005,27(1):96-98.

[5]韋國兵,胡奇軍,廖夫生.HPLC法測定銀黃口服液中黃芩苷含量[J].江西師范大學學報,2013,35(5):79-82.

[6]國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJF 1059-1999測量不確定度評定與表示[S].北京:中國計量出版社,1999:1-11.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:1082-1083.

[8]韋國兵,胡奇軍,張秀秀.HPLC測定銀黃顆粒中綠原酸含量及不確定度分析[J].江西中醫(yī)藥大學學報,2014,26(5):60-63.

[9]李卓,李湘斌.反相HPLC法測定咽喉炎合劑中黃芩苷的含量[J].中南醫(yī)學科學雜志,2010,38(4):64-65.

[10]田冀媛.HPLC-MS法測定人血漿奧美拉唑的水平[J].中南醫(yī)學科學雜志,2008,36(3):52-55.

Determination of Baicalin in Yinhuang Oral Liquid by HPLC and evaluation of its measurement uncertainty

Ling-ling HE,Guo-bing WEI,Qi-jun HU
(Pharmacy College,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang,Jiangxi 330004,P.R.China)

【Objective】To establish a HPLC method for the determination of Baicalin in Yinhuang Oral Liquid and carry on the Uncertainty Analysis to the HPLC method.【Methods】The HPLC method is adopted to measure the content of Baicalin,and the data is verified in terms of methodology.Then the uncertainty,which is drawn into during the process of the determination,will be evaluated.As a result,the combined uncertainty can be worked out. The uncertainty is calculated under 95%confidence interval.【Results】The uncertainty of Baicalin in Yinhuang O－ral Liquid is 2.40%by adopting this method.【Conclusion】The HPLC method established for Baicalin is accurate and reproducible,and the established uncertainty analysis can be applied to the uncertainty analysis of high performance liquid chromatography method in the determination of active ingredient in drugs.

Yinhuang Oral Liquid;Baicalin;HPLC;uncertainty

1005-8982（2015）34-0015-04

R944.5

A

2015-03-12

江西省衛(wèi)生和計劃生育委員會項目（No：2014A008），江西中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥專項（No：ZX1013）