李源棟，劉秀明，段焰青，張翼鵬，王文元，者 為，王家俊，夏建軍

（云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650202）

UPLC指紋圖譜在煙用香精質(zhì)量控制中的應(yīng)用研究

李源棟，劉秀明，段焰青，張翼鵬，王文元，者 為，王家俊，夏建軍

（云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650202）

為快速有效地控制不同批次煙用香精的質(zhì)量，采用超高效液相色譜法（UPLC）法對同種香精9個不同批次樣品的成分進(jìn)行分析，通過計算色譜峰的相對保留值（a）和相對峰面積（Sr）建立香精樣品的指紋圖譜，并通過指紋圖譜的聚類分析和主成分分析對樣品進(jìn)行模式識別。結(jié)果表明：聚類分析和主成分分析能夠區(qū)分稀釋及摻兌的香精樣品，驗證該方法的準(zhǔn)確、可行性，可以作為香精質(zhì)量穩(wěn)定性控制的一種有效手段。

香精；超高效液相色譜；指紋圖譜；聚類分析；主成分分析

0 引 言

在卷煙的生產(chǎn)過程中，為了提高卷煙的燃吸品質(zhì)，改善卷煙口感，突出煙草風(fēng)格，需要使用各種煙用香精[1]。煙用香精是由多種香料和適量溶劑調(diào)和制成的混合物，受原料產(chǎn)地、加工工藝等多種因素影響，產(chǎn)品質(zhì)量存在一定的波動性。因此，煙用香精質(zhì)量的穩(wěn)定性倍受香精生產(chǎn)企業(yè)和卷煙企業(yè)的關(guān)注。以往大多卷煙生產(chǎn)企業(yè)主要通過香精的酸度、溶混度、折光指數(shù)、揮發(fā)性總量以及旋光度等物性指標(biāo)和人工品吸來對香精質(zhì)量進(jìn)行控制，但這些方法很難反映出香精內(nèi)在化學(xué)成分變化，給質(zhì)量控制帶來困難[2-4]。指紋圖譜法通過對樣品色譜峰的相對保留值和其相應(yīng)的色譜峰峰面積進(jìn)行量化處理，實現(xiàn)譜圖數(shù)據(jù)化，提高樣品間的可比性[5]。目前建立煙用香精的指紋圖譜分析方法主要是通過氣相色譜法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-8]和液相色譜法[9-11]，但是這些方法都存在一定的局限性；氣相色譜主要用于檢測香精中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分，液相色譜主要用于檢測香精中的難揮發(fā)性成分，而煙用香精中存在很多難揮發(fā)成分，這些成分有可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)主要應(yīng)用于藥物、食品、化妝品等方面的研究[12-14]，與傳統(tǒng)的液相色譜技術(shù)相比，UPLC能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期，特別適用于微量復(fù)雜混合物的分離和高通量研究[15]。因此，本文采用超高效液相色譜法建立了A煙用香精樣品的指紋圖譜，通過稀釋及摻兌實驗結(jié)合聚類分析和主成分分析對香精樣品進(jìn)行了模式識別，旨在為煙用香精的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備及試劑

Waters超高壓液相色譜儀（美國Waters公司），配備二極管陣列檢測器（PDA）和Empower色譜工作站；電子分析天平（感量0.1 mg）；MILLI.Q純水機(jī)（MILLIPORE公司）。

乙腈、無水乙醇、甲酸均為色譜純；丙二醇、萘為分析純；超純水；9批次A煙用香精（紅云紅河集團(tuán)香精香料制備中心提供），記為1#～9#。

1.2 含內(nèi)標(biāo)的萃取溶液

準(zhǔn)確稱取萘標(biāo)準(zhǔn)品1 g左右于燒杯中，精確至0.1mg，用適量的乙腈溶解，并定容于100mL的容量瓶中，密封保存在-5℃的冰箱中。

取10 mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于1 000 mL的容量瓶中，用超純水、乙腈等體積混合的溶液定容，作為萃取溶液，此溶液萘質(zhì)量濃度為150.25μg/mL。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.0g樣品于50mL錐形瓶中，精確至0.1mg，準(zhǔn)確加入10mL萃取溶液，室溫下超聲15min。取適量溶液過0.22μm有機(jī)相濾膜，待分析。

1.4 煙用香精的稀釋實驗

用1：1（乙腈/水，V∶V）稀釋液將其中任意一批A香精樣品稀釋為90%，80%，70%（體積分?jǐn)?shù)）的樣品，記為10#，11#，12#，分別取1.0g上述樣品于50mL錐形瓶中，精確至0.1 mg，準(zhǔn)確加入10 mL萃取溶液，室溫下超聲15min。取適量溶液過0.22μm有機(jī)相濾膜，待分析。

1.5 煙用香精的摻兌實驗

在A類香精樣品中分別摻入其他香精樣品15%，25%，50%（體積分?jǐn)?shù)），記為13#，14#，15#。分別取1.0g上述樣品于50mL錐形瓶中，精確至0.1mg，準(zhǔn)確加入10mL萃取溶液，室溫下超聲15min。取適量溶液過0.22μm有機(jī)相濾膜，待分析。

1.6 液相色譜分析條件

液相色譜柱：UPLC BEH C18（2.1mm×100mm× 1.7 μm）；流動相A：0.1%甲酸，流動相B：乙腈；柱溫為30℃；流量為0.2 mL/min；檢測波長為275 nm；進(jìn)樣量：2μL；洗脫方式：梯度洗脫（見表1）。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑

萃取溶劑需對香精香料樣品有良好的溶解性，能最大限度地避免有效成分的損失，保留樣品中的各種成分，而且具有較強(qiáng)的峰形，使指紋圖譜能更全面準(zhǔn)確地反映出產(chǎn)品的特征，監(jiān)控每一種物質(zhì)的變化。由于香精的成分比較復(fù)雜，因此使用單一溶劑很難將香精中的成分完全溶解，考慮煙用香精中使用比較多的溶劑，如丙二醇、乙醇、甲醇、乙腈，本文通過對比實驗，最終確定使用等體積的乙腈/水混合溶劑作為溶解香精的溶劑。

2.2 色譜柱的優(yōu)選

分別采用UPLC HSS T3（1.0mm×100mm×1.8μm）、Kinetex C18（2.1mm×150mm×1.7μm）、UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm×1.7 μm）、UPLC BEHC18（2.1 mm× 50 mm×1.7 μm）等色譜柱作為分離柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UPLCBEHC18（2.1mm×100mm×1.7μm）色譜柱對A香精樣品特征峰的分離效果較好。

2.3 檢測波長優(yōu)選

通過PDA 200～400nm全掃描，發(fā)現(xiàn)檢測波長為230nm以下時，由于其靠近流動相的截止波長，溶劑吸收明顯，基線在分析過程中有提升現(xiàn)象。檢測波長為275nm時，A香精樣品色譜峰數(shù)都較多，且響應(yīng)值較高，所以檢測波長選擇275nm比較適宜。

2.4 精密度和穩(wěn)定性實驗

同一樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，各個色譜峰相對峰面積和相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。每天一次，連續(xù)5d對同一樣品進(jìn)行分析，各個色譜峰相對峰面積和相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。則說明該方法具有較好的精密度和穩(wěn)定性。

2.5 煙香精指紋圖譜建立及評價

色譜研究中，相對保留時間相同的峰，即為共有峰。由表2可以看出，11個色譜峰為9個批次A香精樣品所共有，共有指紋峰的峰面積均占總峰面積96%，因此可選擇這11個色譜峰作為判別A香精的群體特征峰，以萘內(nèi)標(biāo)峰作為內(nèi)參照峰求出共有指紋峰的相對保留時間a值和相對峰面積Sr值（見表2），并建立A類香精的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（見圖1）。

圖1 A香精樣品的UPLC指紋圖譜

表2 9批次A香精共有峰及相似度

相似度反映供試樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜之間的相似程度，可以用于樣品的鑒別，通常采用歐氏距離、相關(guān)系數(shù)、夾角余弦等方法來計算各個樣品之間的相似度[16]。本實驗采用夾角余弦法計算出各圖譜的相似度。實驗結(jié)果如表2所示，9個批次的A香精樣品的指紋圖譜相似度均在0.999以上，說明所選樣品存在較高的相似度，所建立的指紋圖譜準(zhǔn)確可靠。

2.6 指紋圖譜的模式識別

指紋圖譜法通過對樣品色譜峰的相對保留值和其相應(yīng)的色譜峰峰面積進(jìn)行量化處理，實現(xiàn)譜圖數(shù)據(jù)化，提高樣品間的可比性，其反映的化學(xué)成分信息具有高度選擇性，綜合表現(xiàn)成物質(zhì)自身的“化學(xué)條碼”，可用于區(qū)別物質(zhì)的真?zhèn)?。本文根?jù)色譜峰的相對峰面積，對9批次A香精樣品、3個稀釋香精樣品及3個摻兌樣品進(jìn)行聚類分析和主成分分析。

圖2 香精樣本的聚類分析

圖3 香精樣本指紋圖譜的主成分二維投影

利用統(tǒng)計學(xué)軟件中聚類、主成分分析程序?qū)ι鲜?批次A類香精樣品、稀釋樣品及摻兌樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分組和主成分分析。圖2是對上述15個樣品進(jìn)行聚類分析的結(jié)果，聚類樹狀圖直觀地顯示了15個樣品逐步合并的過程，其中聚類樹狀圖上橫坐標(biāo)為臨界值即為類間的距離，縱坐標(biāo)為樣品號。臨界值越小，表示樣品的相似度越高，在臨界值約為1.5時，15個樣品被分成3類，9批次A類香精樣品、稀釋香精樣品及摻兌樣品各自聚在一起，并且隨著臨界值的增大，15個香精樣品逐步合并聚成一類，這種聚類的規(guī)律與樣品的差異性保持一致，因此，通過聚類分析能夠準(zhǔn)確區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)香精樣品、稀釋香精樣品及摻兌樣品。圖3為15個樣品的散點圖，其中圖上每一個散點分別代表一個樣品，點與點之間的距離代表各個樣品之間存在的特征差異程度。可以看出，9個標(biāo)準(zhǔn)香精樣品均聚集于圖中的右側(cè)部分，構(gòu)成一個較為獨(dú)立的組群，表明9批次香精樣品具有明顯的相似性。其余稀釋樣品和摻兌樣品聚集在圖左側(cè)，與9批次香精樣品相比，呈現(xiàn)出明顯的差異性，這與聚類分析結(jié)果一致。

3 結(jié)束語

本文采用UPLC建立了A類香精的色譜指紋圖譜，采用夾角余弦計算其相似度，并針對煙用香精的有效含量問題進(jìn)行了稀釋及摻兌，通過化學(xué)計量學(xué)中主成分分析和聚類分析的模式識別方法對同種香精樣本、稀釋樣本及摻兌進(jìn)行分類，取得了滿意的結(jié)果。本方法為探討香精質(zhì)量穩(wěn)定性的控制提供了一種新的途徑。

[1]曲國福，孟昭宇，陸舍銘，等.香料指紋圖譜及其在煙用香精質(zhì)量控制中的應(yīng)用概述[J].煙草科技，2006（5）：47-50.

[2]廖堃，胡綱.煙用香精揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分的色譜指紋圖譜分析及模式識別[J].分析測試學(xué)報，2005，24（6）：372-374.

[3]朱書奎，路鑫，邢鈞，等.全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜用于煙用香精化學(xué)組分的分析[J].分析化學(xué)，2006，34（2）：191-195.

[4]王鈞，趙日利.色譜指紋圖譜對香精香料質(zhì)量控制的研究[J].中國測試技術(shù)，2005，31（3）：45-46.

[5]洪筱坤，王智華.色譜指紋譜在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中的應(yīng)用[J].中成藥，2001，23（3）：157-159.

[6]廖堃，張翼，肖競.頂空-液相微萃取在煙用香精分析中的應(yīng)用[J].煙草科技，2007（6）：39-43.

[7]黃世杰，王維剛，蔣宏霖，等.GC-MS法結(jié)合聚類分析用于煙用香精質(zhì)量控制的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（14）：6344-6346.

[7]郭方遒，鐘科軍，黃建國，等.煙用香精香氣成分提取方法的選擇[J].煙草科技，2005（12）：20-21.

[8]郭紫明，董道竹，李燕春，等.氣相色譜-質(zhì)譜法和主成分投影分析法用于煙用香精的分析和質(zhì)量控制[J].理化檢驗：化學(xué)分冊，2008（44）：22-26.

[9]李希強(qiáng)，王笛，陸舍銘，等.皮爾遜相關(guān)系數(shù)與UPLC相結(jié)合研究煙用香精香料指紋圖譜[J].精細(xì)化工，2008，25（5）：475-478.

[10]趙瑜，楊華武，鐘科軍，等.煙用香精的超高壓液相色譜指紋圖譜分析[J].香精香料化妝品，2009（4）：19-21.

[11]李希強(qiáng)，陸舍銘，王笛，等.煙用香精UPLC指紋圖譜的夾角余弦、相關(guān)系數(shù)與歐氏距離評價[J].煙草化學(xué)，2008（12）：37-41.

[12]楊筱麗，李耿超.高效液相色譜法同時測定解郁丸中芍藥苷和阿魏酸的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（11）：946-947.

[13]李永夫，高華鵬，張健玲，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鰻魚中呋線威和溴氰菊酯殘留[J].分析化學(xué)，2008，36（6）：755-759.

[14]鄭和輝，李潔，吳大南，等.超高效液相色譜法檢測化妝品中鄰苯二甲酸酯[J].分析試驗室，2008，27（7）：75-77.

[15]馬強(qiáng)，王超，王興，等.超高效液相色譜法同時測定化妝品中的15種激素[J].色譜，2007，25（4）：541-545.

[16]陳軍輝，陶力，李俊，等.生物化學(xué)實驗[M].北京：科學(xué)出版社，2003：63-64.

Studies on UPLC fingerprints in tobacco flavor quality control

LI Yuandong，LIU Xiuming，DUAN Yanqing，ZHANG Yipeng，WANG Wenyuan，ZHE Wei，WANG Jiajun，XIA Jianjun
（Technology Center，China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming 650202，China）

To quickly and effectively control the quality of different batches of tobacco flavor.Use the ultra-high performance liquid chromatography（UPLC）to analyze the ingredients of nine sample batches of flavor of a sort;establish flavor sample fingerprints to calculate the relative retention value（a）and relative peak area（Sr）of chromatographic peak；and carry out pattern recognition for samples based on clustering and principal component analysis of the fingerprint.The above clustering and principal component analysis can distinguish the diluted flavor samples from mixed ones.This method is accurate and reliable and can be used as an efficient means for stability control of tobacco flavor quality.

tobacco flavor；UPLC；fingerprint；clustering analysis；principal component analysis

A

：1674-5124（2015）05-0050-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.05.013

2014-09-26；

：2014-11-29

云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司資助項目（2014JC07）

李源棟（1985-），男，湖南永順縣人，碩士，主要從事煙用香精香料研究工作。