吳慧昊 ，陳 強(qiáng)，鐘 琦 ，付信磊，陳俊楠

(1.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030)

高產(chǎn)脂肪酶菌株篩選

吳慧昊1，陳 強(qiáng)2，鐘 琦2，付信磊2，陳俊楠2

(1.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030)

以實(shí)驗(yàn)室所提供的12株酵母菌菌株為試驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行活化和擴(kuò)大培養(yǎng)，通過初篩及復(fù)篩，篩選出高產(chǎn)脂肪酶菌株，并采用酸堿滴定法測(cè)定酶活力.經(jīng)過選擇培養(yǎng)基復(fù)篩選出6株透明圈較大的菌株，對(duì)其測(cè)定酶活.結(jié)果表明，菌株CC06具有較高的脂肪酶活性，脂肪酶活力為31.67 U/mL.

脂肪酶；菌株篩選；酶活力

微生物脂肪酶，又稱三?；视王；饷福侵阜纸饣蚝铣筛呒?jí)脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯鍵的酶.本世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)微生物脂肪酶以來，由于其種類多，具有比動(dòng)物脂肪酶更廣的作用，且pH值、作用溫度范圍和對(duì)底物的專一性便于進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn) ，而得到廣泛關(guān)注和研究[1].

微生物脂肪酶催化反應(yīng)是：甘油三酸脂+水→甘油二酸脂+游離脂肪酸→甘油酸脂+游離脂肪酸→甘油+游離脂肪酸.脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反應(yīng)是在2個(gè)彼此分離的完全不同的相的界面上進(jìn)行.

隨著現(xiàn)階段人們對(duì)微生物的重視程度越來越高，有關(guān)微生物脂肪酶研究也不斷深入.最近幾十年，隨著工業(yè)化應(yīng)用對(duì)脂肪酶性質(zhì)的不同需求，能夠產(chǎn)生具有特定酶學(xué)性質(zhì)的脂肪酶微生物種類不斷增加，目前遍及酵母菌屬、霉菌屬等[2～3].但大部分脂肪酶菌株的酶催化效率不高，對(duì)于脂肪酶高產(chǎn)菌的研究正在不斷深入.

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)室傳代保存的12株酵母菌菌株.

1.1.1 試劑

對(duì)硝基棕櫚酸苯酯(p-NPP)、2%聚乙烯醇(簡(jiǎn)稱PVA，聚合度1750)、pH7.5磷酸緩沖液、0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液、橄欖油、95%乙醇、10 g/L酚酞指示劑.

1.1.2 培養(yǎng)基

油脂培養(yǎng)基：每升含 10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 gNaCl、10 g花生油、1 mL 1.6%中性紅水溶液、17.5 g瓊脂.用0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH至7.2.

麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基：每升含1 g葡萄糖、1.8 g KCl、2.5 g酵母浸膏、8.2 g醋酸鈉、17.5 g瓊脂.

復(fù)篩培養(yǎng)基：每升含1 g(NH4)2SO4、1 gK2HPO4、0.5 gKCl、0.1 gMgSO4·7H2O、10 g橄欖油、1 g聚乙烯醇、17.5 g瓊脂.用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5.

脂肪酶驗(yàn)證培養(yǎng)基：每升含10 g蛋白酶、5 gNaCl、0.1 gCaCl2·7H2O、17.5 g瓊脂.用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4.

選擇性培養(yǎng)基：每升含0.5 g(NH4)2SO4、0.5 gNaCl、0.2 gMgSO4·7H2O、0.5 g 酵母粉、17.5 g瓊脂.用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2.將上述溶液滅菌冷卻至60 ℃左右加入均壓后的2%聚乙烯醇橄欖油乳化液 ( V 橄欖油︰V 2%聚乙烯醇 = 1︰3)，用紫外燈照射滅菌30 min以上備用.

1.2 方法

1.2.1 菌株活化留種

將實(shí)驗(yàn)室中置于4 ℃冰箱下的12株菌株取出，接種于液體麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，并于超凈工作臺(tái)內(nèi)畫斜面，確保菌體不被污染.活化完畢，將菌株置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng).

1.2.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩

將實(shí)驗(yàn)室提供的12株菌株在油脂培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)48 h，觀察是否長(zhǎng)出紅色菌株，篩選并留種.

1.2.3 產(chǎn)脂肪酶菌株的復(fù)篩

將經(jīng)過初篩的10株菌株，活化后取接種針點(diǎn)種于配制好的選擇性培養(yǎng)基中(注：培養(yǎng)基聚乙烯醇必須與橄欖油徹底交融)，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察所長(zhǎng)菌落周圍有無透明光圈，利用測(cè)微尺測(cè)定光圈直徑與菌落直徑，記錄數(shù)據(jù)并挑選直徑比大的菌株進(jìn)行酶活力測(cè)定.

1.2.4 脂肪酶活力測(cè)定

采用酸堿滴定法測(cè)定脂肪酶活力[4].測(cè)定原理：脂肪酶在一定條件下，能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單脂和甘油，所釋放的脂肪酸可用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行中和滴定，用pH計(jì)或酚酞指示反應(yīng)終點(diǎn).根據(jù)消耗的量，計(jì)算其酶活力，反應(yīng)式為：RCOOH + NaOH →RCOONa + H2O.

酶活力單位：在37 ℃水浴條件下，每分鐘分解底物產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量定義為一個(gè)脂肪酶活力單位(U).

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩

脂肪酶驗(yàn)證培養(yǎng)基常用來驗(yàn)證所選菌株是否產(chǎn)生脂肪酶，在經(jīng)過培養(yǎng)后若培養(yǎng)基呈紅色，表明該菌株能產(chǎn)生脂肪酶.如圖1所示，初篩共篩選出6株菌株具有產(chǎn)脂肪酶能力.

表1 產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩結(jié)果

2.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的復(fù)篩

聚乙烯醇選擇性培養(yǎng)基能夠挑選出菌株中產(chǎn)酶能力較高的菌株，利用透明光圈和菌落的直徑比大小能很清晰地了解菌株的產(chǎn)酶能力.直徑比越大的表示其產(chǎn)酶能力越高.實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果見表2.

表2 菌株復(fù)篩結(jié)果

2.3 酶活力測(cè)定

選取6株復(fù)篩菌株，采用滴定法進(jìn)行酶活力測(cè)定，由表3可知編號(hào)為CC06菌株的酶活力最高，為31.67 U/mL，其余菌株酶活力較低，酶活力測(cè)定與復(fù)篩結(jié)果基本一致.

表1 菌株酶活力測(cè)定值

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果表明，復(fù)篩選出6株透明圈較大的菌株，酶活力大小分別為: CC06>XZ>AC03>ZC006>ZC005>ZC004；產(chǎn)脂肪酶活力最好的菌株是CC06，其酶活力的大小為31.67 U/mL.

脂肪酶可以催化油脂選擇性水解與其他酯類的轉(zhuǎn)酯、氨解等反應(yīng)，是一種重要的工業(yè)用酶，被廣泛應(yīng)用于油脂水解、食品風(fēng)味的改進(jìn)、醫(yī)療醫(yī)藥、皮革絹紡脫脂、低等油脂的改性等[5].近年來還大量用作生物柴油制備過程中的催化劑，酶法生產(chǎn)生物柴油技術(shù)具有產(chǎn)物提取簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、甘油容易回收和無廢物產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)[7～10].另外，HanSoojin 等[11]發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌所產(chǎn)的胞外脂肪酶具有甲醇耐受性，而對(duì)乙醇則不耐受.這一點(diǎn)使該菌脂肪酶在用于酯化反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油方面具有一定的應(yīng)用潛力.由此可見，選育高產(chǎn)脂肪酶菌株將對(duì)工業(yè)生產(chǎn)具有更高層次的實(shí)際意義.

[1] 張樹政.酶制劑工業(yè)(下冊(cè)).脂肪酶[M].北京:科學(xué)出版社,1998.655-670.

[2] Macrae A, Hammond R. Present and future applications of lipases[J]. Biotechnology& Genetic Engineering Reviews,1985,3: 193-217.

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2015-11-20

國(guó)家民委科研項(xiàng)目 (No.14XB2015);西北民族大學(xué)本科生開放實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目.

吳慧昊(1985—)，女，甘肅甘南人，實(shí)驗(yàn)師,主要從事微生物營(yíng)養(yǎng)方面的研究.

Q933

A

1009-2102(2015)04-0051-03