胡 燕，齊桂年

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院， 四川 雅安 625014)

四川黑茶的高效液相色譜指紋圖譜研究

胡 燕，齊桂年

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院， 四川 雅安 625014)

【目的】 應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)研究四川黑茶的指紋圖譜，為四川黑茶的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考?！痉椒ā?以四川省11個(gè)不同生產(chǎn)廠家的22個(gè)黑茶樣品及我國(guó)其他黑茶主產(chǎn)區(qū)的13個(gè)黑茶樣品為試驗(yàn)材料，采用線性梯度洗脫，以甲醇和體積分?jǐn)?shù)2%乙酸水溶液為流動(dòng)相，在柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1.0 mL/min條件下構(gòu)建四川黑茶HPLC指紋圖譜的共有模式，分析各樣品與該共有模式的相似度，并對(duì)35個(gè)黑茶樣品進(jìn)行聚類分析?！窘Y(jié)果】 確定了14個(gè)色譜峰為四川黑茶的共有峰；精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)中各共有峰的相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3.00%；22個(gè)四川黑茶樣品與共有模式的相似度為0.825～0.978；對(duì)相對(duì)峰面積的聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)臨界值為10時(shí)，35個(gè)來(lái)自全國(guó)不同產(chǎn)地的黑茶樣品可聚為4類，來(lái)自四川的22個(gè)黑茶樣品可聚為一大類?！窘Y(jié)論】 根據(jù)構(gòu)建的四川黑茶的HPLC指紋圖譜，可以鑒定和評(píng)價(jià)除方包茶之外的四川黑茶。

四川黑茶；高效液相色譜法；化學(xué)指紋圖譜；聚類分析

黑茶是我國(guó)六大茶類之一，屬于后發(fā)酵茶，以邊銷為主，主產(chǎn)區(qū)為湖南、四川、云南、湖北、廣西等省[1]。黑茶因產(chǎn)地、原料拼配比例和加工工藝等方面的差別，其內(nèi)含物質(zhì)如多酚類、咖啡堿、茶色素等的種類和含量均存在差異。四川黑茶是我國(guó)黑茶類的一個(gè)重要組成部分，其生產(chǎn)歷史悠久，品種主要為南路邊茶康磚、金尖和西路邊茶茯磚、方包等。目前對(duì)四川黑茶的研究主要集中在品質(zhì)化學(xué)成分[2-5]、加工過(guò)程中微生物種群的分離鑒定[6-7]和降氟技術(shù)[8]等方面；現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)四川黑茶品質(zhì)的評(píng)價(jià)主要是測(cè)定水分、總灰分、水浸出物等理化指標(biāo)并結(jié)合感官審評(píng)[9-11]，但難以全面反映其品質(zhì)。

化學(xué)指紋圖譜是指在固定的試驗(yàn)條件下，將待測(cè)物經(jīng)適當(dāng)處理后得到的能標(biāo)示其化學(xué)特征的譜圖[12]，可分為光譜指紋、色譜指紋、波譜指紋圖譜以及采用多種現(xiàn)代分析儀器得到的多維多息特征譜等，其中高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜適用于分析茶葉中的非揮發(fā)性成分[13]?；瘜W(xué)指紋圖譜技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于中藥的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量控制、新藥開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域[14-16]，但應(yīng)用于黑茶的研究較少[17-19]。因此，本試驗(yàn)初步構(gòu)建了四川黑茶的HPLC指紋圖譜，綜合評(píng)價(jià)四川黑茶中非揮發(fā)性成分的化學(xué)特征，以期為四川黑茶的鑒別和質(zhì)量的客觀評(píng)價(jià)提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

22個(gè)(S1～S22)四川黑茶樣品源自四川省的11個(gè)不同生產(chǎn)廠家，13個(gè)(S23～S35)對(duì)照樣品分別采自云南、廣西、湖北、湖南、陜西等黑茶的其他主產(chǎn)區(qū)，所有茶葉樣品的生產(chǎn)年份均為2012年，詳見(jiàn)表1。

1.2 儀器與試劑

主要儀器有：島津LC-20A高效液相色譜儀(配有在線真空脫氣裝置、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器)，LCsolution色譜工作站(日本島津)，超聲波清洗器(上海冠特超聲波儀器有限公司)，電子天平(德國(guó)賽多利斯股份公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)和微型植物實(shí)驗(yàn)粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

主要試劑有：色譜純甲醇(美國(guó)Fisher公司)，二次蒸餾水，分析純乙酸(天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心)，咖啡堿(CAF)、沒(méi)食子酸(GA)、兒茶素(C)標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)。

1.3 樣品前處理

稱取2.00 g粉碎茶樣(過(guò)40目篩, 篩孔孔徑為0.425 mm)于250 mL具塞錐形瓶中，加入140 mL 90 ℃的蒸餾水，立即移入90 ℃水浴中浸提15 min，每隔5 min搖動(dòng)1次。浸提完畢后，冷卻至室溫，離心15 min(轉(zhuǎn)速4 000 r/min)，取上清液，用0.45 μm水相濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析；同時(shí)，采用相同的色譜條件取CAF、GA、C標(biāo)準(zhǔn)品溶液上機(jī)分析。

1.4 色譜條件

流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)2%乙酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇；色譜柱為漢邦科技Lichrospher C18色譜柱(5 μm×250 mm×4.6 mm)。檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min。分析時(shí)間65 min。

梯度洗脫程序：0～8 min，3%～10%B；8～15 min，10%～17%B；15～20 min，17%～21%B；20～28 min，21%～24%B；28～33 min，24%～40%B；33～48 min，40%～70%B；48～60 min，70%～30%B；60～65 min，30%～3%B。系統(tǒng)平衡色譜柱時(shí)間為15 min。

1.5 方法學(xué)考察

取同一黑茶樣品按1.3中的條件制備，在1.4中的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，以7號(hào)峰為參照峰，考察儀器的精密度。

取同一黑茶樣品5份，按1.3中的條件平行制備，在1.4中的色譜條件下分別進(jìn)樣檢測(cè)，以7號(hào)峰為參照峰，考察試驗(yàn)方法的重現(xiàn)性。

取同一黑茶樣品按1.3中的條件制備，分別放置0，2，4，8，12，16，20和24 h，然后按1.4中的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以7號(hào)峰為參照峰，考察黑茶樣品提取液的穩(wěn)定性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

將四川黑茶樣品的HPLC圖譜通過(guò)LCsolution色譜工作站以AIA格式導(dǎo)出，然后分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004 A版)軟件中，生成四川黑茶的HPLC指紋圖譜共有模式，計(jì)算四川黑茶樣品及對(duì)照樣品與四川黑茶共有模式的相似度；將22個(gè)四川黑茶樣品及13個(gè)對(duì)照樣品中各共有峰的相對(duì)峰面積與樣品編號(hào)建立矩陣，采用SPSS 19.0軟件，選擇組間聯(lián)接及連續(xù)變量的歐氏距離平方對(duì)供試黑茶樣品進(jìn)行聚類分析[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑茶HPLC指紋圖譜方法的考察

在精密度試驗(yàn)中，HPLC圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.31%～1.28%和0.75%～1.96%，表明儀器的精密度良好。在重現(xiàn)性試驗(yàn)中，HPLC圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.22%～1.42%和0.75%～2.06%，表明試驗(yàn)方法的重現(xiàn)性良好。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，HPLC圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.98%～2.04%和1.16%～2.29%，表明黑茶樣品提取液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 四川黑茶HPLC指紋圖譜的構(gòu)建

四川省11個(gè)不同廠家22個(gè)黑茶樣品的HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖1，其HPLC指紋圖譜共有模式見(jiàn)圖2。選擇出峰時(shí)間適中、峰面積在色譜圖中所占比例較大,且在各個(gè)四川黑茶樣品中均穩(wěn)定存在的7號(hào)峰作為參照峰，分別計(jì)算各樣品組分峰的相對(duì)保留時(shí)間，各組分峰按相對(duì)保留時(shí)間一一匹配后共確定14個(gè)共有峰。經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比較，峰3、6、7分別鑒定為GA、C和CAF；22個(gè)四川黑茶樣品各共有峰的平均相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表2；分別計(jì)算13個(gè)對(duì)照茶樣中各組分峰的相對(duì)保留時(shí)間并與四川黑茶比較，發(fā)現(xiàn)四川黑茶中的14個(gè)共有峰在對(duì)照茶樣中均穩(wěn)定存在，各色譜圖中共有峰面積占總峰面積的比例均在90%以上。因此，僅通過(guò)四川黑茶共有峰不能將四川黑茶與我國(guó)其他產(chǎn)區(qū)的黑茶樣品進(jìn)行有效區(qū)分。

圖1 22個(gè)四川黑茶樣品的HPLC指紋圖譜S1～S22.所示樣品同表1
Fig.1 HPLC fingerprinting of 22 Sichuan dark tea samples S1-S22.Same as table 1

2.3 不同產(chǎn)地黑茶樣品HPLC指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)

從表3可以看出，22個(gè)四川黑茶樣品與四川黑茶共有模式的相似度在0.825～0.978，除2個(gè)方包茶樣品與共有模式的相似度較低外，其余20個(gè)樣品的相似度均大于0.900，說(shuō)明它們所含的化學(xué)成分相似，質(zhì)量較穩(wěn)定；其他省份的黑茶樣品與四川黑茶共有模式的相似度在0.709～0.928，相似度的差異說(shuō)明，不同產(chǎn)地、不同品種的黑茶樣品由于加工工藝和原料的品種、嫩度等有別，其內(nèi)含化學(xué)成分及含量可能存在一定的差異。

注：S1～S35.所示樣品同表1。

Note:S1-S35.Same as table 1.

2.4 不同產(chǎn)地黑茶樣品的聚類分析

從圖3可以看出，當(dāng)臨界值為10時(shí)，35個(gè)來(lái)自不同產(chǎn)地的黑茶樣品可聚為4類：來(lái)自四川的22個(gè)黑茶樣品可聚為一大類，在這一大類中，加工工藝相同的10個(gè)康磚茶樣品、8個(gè)金尖茶樣品、2個(gè)方包茶樣品分別聚為一小類，來(lái)自陜西咸陽(yáng)的涇渭七子茯茶與四川茯磚茶聚為一小類，這與相似度的分析結(jié)果一致；來(lái)自湖南的6個(gè)黑茶樣品聚為一大類；來(lái)自云南和湖北的4個(gè)黑茶樣品聚為一大類；來(lái)自廣西的2個(gè)六堡茶樣品單獨(dú)聚為一大類。不同黑茶樣品中各共有峰相對(duì)峰面積的聚類分析結(jié)果表明，不同原料產(chǎn)地對(duì)黑茶內(nèi)含化學(xué)成分的影響較大，可利用聚類分析對(duì)我國(guó)不同產(chǎn)地和加工工藝的黑茶樣品進(jìn)行初步區(qū)分。

3 討 論

目前，對(duì)黑茶HPLC指紋圖譜的研究主要集中于普洱茶，而對(duì)四川黑茶的HPLC指紋圖譜研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)初步構(gòu)建了四川黑茶的HPLC指紋圖譜，結(jié)果顯示，22個(gè)四川黑茶樣品均有14個(gè)共有峰，但峰面積存在差異，說(shuō)明不同廠家、不同品種的四川黑茶樣品，由于原料和生產(chǎn)工藝略有差異，造成其內(nèi)含化學(xué)成分含量的不同；相似度分析結(jié)果表明，其他省份的黑茶樣品與四川黑茶HPLC指紋圖譜共有模式的相似度在0.709～0.928，因此僅通過(guò)四川黑茶中的共有峰及相似度評(píng)價(jià)，不能將四川黑茶與我國(guó)其他產(chǎn)區(qū)的黑茶樣品進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，而將各共有峰的相對(duì)峰面積與樣品編號(hào)建立矩陣后進(jìn)行聚類分析能初步區(qū)分我國(guó)不同產(chǎn)地的黑茶樣品。方包茶是四川西路邊茶中的一個(gè)主要花色品種。本研究結(jié)果表明，2個(gè)方包茶樣品與四川黑茶HPLC指紋圖譜共有模式的相似度較低，這可能與原料及加工工藝不同有關(guān)，生產(chǎn)方包茶的鮮葉原料比南路邊茶更為成熟，是采割1～2年生的成熟枝梢直接曬干制成，含梗量達(dá)60%。本試驗(yàn)采用HPLC指紋圖譜分析技術(shù)，得到了有關(guān)四川黑茶質(zhì)量的綜合信息，比通過(guò)單一成分測(cè)定得到的結(jié)果更為豐富和全面；但與中藥材相似，黑茶作為后發(fā)酵茶，其大多數(shù)活性成分都是次生代謝產(chǎn)物，本身就存在內(nèi)在的不穩(wěn)定性，這也是黑茶指紋圖譜研究的難點(diǎn)，這就需要實(shí)施茶葉的規(guī)范化種植，并運(yùn)用聯(lián)用技術(shù)獲得黑茶的多維多息特征譜，以更好地對(duì)黑茶物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究。

4 結(jié) 論

本研究初步構(gòu)建了四川黑茶的HPLC指紋圖譜，22個(gè)四川黑茶樣品中有20個(gè)樣品與共有模式的相似度在0.902～0.978，而其他省份的黑茶樣品與四川黑茶共有模式的相似度均較低；聚類分析也證實(shí)，來(lái)自四川的22個(gè)黑茶樣品可聚為一大類。本研究結(jié)果在一定程度上為四川黑茶的鑒別和質(zhì)量的客觀評(píng)價(jià)提供了理論參考。

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High performance liquid chromatographic fingerprinting of Sichuan dark tea

HU Yan,QI Gui-nian

(CollegeofHorticulture,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China)

【Objective】 The fingerprinting of Sichuan dark tea was studied using HPLC to improve its identification and quality assessment.【Method】 22 Sichuan dark tea samples from 11 different manufacturers and 13 dark tea samples from other regions of China were selected as experimental materials.A suitable chromatographic system was established using a linear gradient elution with methanol and water containing 2% acetic acid as the mobile phase,a detection wavelength of 280 nm and the flow speed of 1.0 mL/min.The common pattern of HPLC fingerprinting of Sichuan dark tea was established,and the similarity index between dark tea samples and the common pattern of Sichuan dark tea were analyzed.The methodology was inspected and cluster analysis of the 35 dark tea samples was conducted.【Result】 There were 14 peaks in chromatograms were determined.The RSD of the relative peak area and the relative retention time of common peaks in test of precision,repeatability,and stability were all less than 3.00%.The similarity index between 22 Sichuan dark tea samples and the common pattern of Sichuan dark tea ranged from 0.825 to 0.978.The cluster analysis on the relative peak area showed that the 35 dark tea samples from different origins could be divided into four types,and the 22 Sichuan dark tea samples belonged one same category.【Conclusion】 The established HPLC fingerprinting can be used to identify and evaluate Sichuan dark teas except Fangbao tea.

Sichuan dark tea;HPLC;chemical fingerprinting;cluster analysis

2013-09-18 [作者簡(jiǎn)介] 胡 燕(1982-),女，四川雅安人，工程師，在讀博士，主要從事園藝植物資源開(kāi)發(fā)與利用研究。

齊桂年(1956-)，男，重慶永川人，教授，博士，主要從事茶葉加工及植物資源開(kāi)發(fā)與利用研究。

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.012

TS272.7

A

1671-9387(2015)01-0134-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.012.html