張 晶，杜 威，趙翊明，和文祥,2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 農(nóng)業(yè)部 西北植物營(yíng)養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

納米炭粉對(duì)土壤微生物活性的影響

張 晶1，杜 威1，趙翊明1，和文祥1,2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 農(nóng)業(yè)部 西北植物營(yíng)養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

【目的】 研究納米炭粉對(duì)土壤脫氫酶活性和微生物量碳含量的影響。【方法】 采用室內(nèi)模擬方法，研究了不同納米炭粉添加量(0.00，1.00，3.00，5.00，10.00，20.00 g/kg)下土壤脫氫酶活性和微生物碳的變化，并分析了不同質(zhì)量濃度納米炭粉(0.0，1.0，3.0，4.5，7.5，15.0，30.0 g/L)對(duì)脫氫酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物——甲臜的吸附作用，以探明是否可用TTC法檢測(cè)脫氫酶活性。【結(jié)果】 與未添加納米炭粉處理相比，添加納米炭粉后土壤脫氫酶活性降低，土壤微生物量碳含量總體略有增加，并保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，表明納米炭粉對(duì)微生物有微弱的激活作用。吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，由于納米炭粉具有較高的吸附性能，其加入后會(huì)很快吸附甲臜，導(dǎo)致產(chǎn)物量過(guò)低，呈現(xiàn)出土壤脫氫酶活性被抑制的假象?！窘Y(jié)論】 納米炭粉可激活土壤微生物活性，采用TTC法分析納米炭粉土壤脫氫酶效應(yīng)的結(jié)果并不可靠，需尋找更加完善的方法。

土壤脫氫酶；微生物量碳；納米炭粉；TTC法

納米材料和碳材料同為材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，將二者結(jié)合制備的碳納米材料具有特殊的結(jié)構(gòu)和性能，近年來(lái)對(duì)其中的碳納米管和富勒烯研究較多。研究表明，一方面由于處于納米尺度，碳納米材料能夠進(jìn)入細(xì)胞，可直接對(duì)動(dòng)植物和人體造成損傷[1]，因此具有環(huán)境毒性；另一方面，由于具有較強(qiáng)的吸附能力，碳納米材料會(huì)富集環(huán)境中的污染物，導(dǎo)致污染物的遷移、轉(zhuǎn)化和歸趨等環(huán)境行為發(fā)生改變，從而表現(xiàn)出污染修復(fù)作用。方惠會(huì)等[2]指出，未純化的碳納米管黏附有大量碳納米顆粒，研究這些顆粒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)對(duì)碳納米材料的應(yīng)用具有重要意義。納米炭粉作為碳納米顆粒的一種，屬于新型輕質(zhì)納米級(jí)無(wú)定型炭素材料[3]，目前已被廣泛應(yīng)用于信息、生物、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等諸多方面[4-5]。

土壤酶是陸地生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中最活躍的生物活性物質(zhì)[6]。脫氫酶是其中的主要酶類(lèi)之一，其與微生物量碳常被用作反映土壤微生物活性的重要指標(biāo)[7-8]。脫氫酶活性測(cè)定方法較多[9]，且基本都是在樣品中加入人工受氫體，在酶作用下發(fā)生脫氫反應(yīng)，人工受氫體接受氫原子被還原發(fā)生顏色改變，從而檢測(cè)酶活性；人工受氫體有亞甲基藍(lán)[10-11]、刃天青[12]、三苯基四氮唑氯化物(TTC)[13-14]以及氯化碘硝基四氮唑(INT)[15]等，最常用的則是TTC。

納米炭粉的大量使用必然會(huì)影響土壤環(huán)境，因此開(kāi)展其土壤效應(yīng)研究，在理論和實(shí)踐上具有重要意義。但目前對(duì)其土壤環(huán)境和土壤酶效應(yīng)的報(bào)道較少。為此，本研究擬采用室內(nèi)模擬方法，探討納米炭粉作用下土壤脫氫酶活性及微生物量碳的變化，以了解二者之間的關(guān)系，為更好地開(kāi)展納米炭粉的生態(tài)毒理效應(yīng)及環(huán)境保護(hù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

納米炭粉購(gòu)自南京埃普瑞納米材料有限公司，基本性質(zhì)為：平均粒徑30 nm，純度99.9%，晶型為不規(guī)則的類(lèi)球形，起始氧化溫度800 K(空氣中)，BET表面積120 m2/g，密度3.02～3.30 g/cm3。納米炭粉掃描電鏡(HITACHI S-4800 SEM)分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 納米炭粉的掃描電鏡結(jié)果
Fig.1 SEM image of nano carbon powders

2個(gè)供試土壤均是采自陜西楊凌農(nóng)田的土婁土。采樣時(shí)，先去除表層(0～5 cm)土樣，然后采集5～20 cm土層土樣，將其風(fēng)干，過(guò)孔徑1 mm篩后備用。供試土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

1.2 方 法

1.2.1 土壤活化 稱(chēng)取2 000 g風(fēng)干土樣，放入塑料盆中，均勻加入蒸餾水，使土壤水分含量達(dá)最大田間持水量的60%，然后放入恒溫培養(yǎng)箱， 28 ℃避光通氣培養(yǎng)7 d[16]。

1.2.2 酶效應(yīng)研究 向300 g活化土壤中，加入不同含量(0.00(對(duì)照)，1.00，3.00，5.00，10.00，20.00 g/kg)納米炭粉，混勻，密封28 ℃避光培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第1，3，5，7，15，30天時(shí)取樣，用TTC法[15]測(cè)定土壤脫氫酶活性，酶活性以1 h 內(nèi)單位質(zhì)量土樣(g) 產(chǎn)生的甲臜(TPF)量(g) 表示；同時(shí)在第1，30天采用氯仿熏蒸TOC法[17]測(cè)定土壤微生物量碳含量。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 吸附試驗(yàn) 向30 g 1號(hào)風(fēng)干土樣中加入600 mg/kg葡萄糖[18]，調(diào)節(jié)含水量為最大田間持水量的60%，添加TTC溶液后恒溫培養(yǎng)24 h，加入100 mL甲醇溶液，振蕩20 min后，4 000 r/min離心5 min提取濾液，獲得甲臜母液；同時(shí)超聲(45 Hz、300 W)30 min制備不同質(zhì)量濃度(0.0，1.0，3.0，4.5，7.5，15.0，30.0 g/L)的納米炭粉膠體溶液，取2 mL不同質(zhì)量濃度納米炭粉膠體溶液，分別加入10 mL甲臜母液，振蕩后離心，吸取上清液，在485 nm波長(zhǎng)比色，測(cè)定溶液中剩余甲臜的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007和SPSS 18.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米炭粉對(duì)土壤脫氫酶活性的影響

脫氫酶主要存在于活細(xì)胞中，作為氧化還原反應(yīng)中氫的中間傳遞體，可以表征微生物整體活性。納米炭粉對(duì)供試土壤脫氫酶活性的影響見(jiàn)表2。

注：同行數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母者表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in each row mean significant difference atP<0.05.

從表2可以看出：在未加納米炭粉的處理中，除第3天外，其余培養(yǎng)時(shí)間下1號(hào)土樣脫氫酶活性均明顯大于2號(hào)土樣。培養(yǎng)第5天時(shí)，1號(hào)與2號(hào)土樣脫氫酶活性差異最大。這與前人的研究結(jié)果[19]一致，主要是1號(hào)土樣有機(jī)質(zhì)等含量較高所致。添加納米炭粉后，土壤脫氫酶活性均小于對(duì)照組處理，表明納米炭粉抑制了土壤脫氫酶活性。隨納米炭粉添加量的增加，脫氫酶活性急劇減小。培養(yǎng)第3天，2號(hào)和1號(hào)土樣分別在納米炭粉添加量為3.00和5.00 g/kg時(shí)，土壤脫氫酶活性幾乎檢測(cè)不到?？梢?jiàn)添加納米炭粉后，有機(jī)質(zhì)含量較低的2號(hào)土樣對(duì)其更敏感。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，低含量納米炭粉處理土壤脫氫酶活性表現(xiàn)出先減小后增加的趨勢(shì)，其中2號(hào)土樣脫氫酶活性變化幅度小于1號(hào)土樣。培養(yǎng)第30天，當(dāng)納米炭粉含量大于5.00 g/kg時(shí)供試土壤脫氫酶活性便無(wú)法檢出。

2.2 納米炭粉對(duì)土壤微生物量碳含量的影響

微生物量碳是評(píng)價(jià)土壤微生物數(shù)量和活性的重要指標(biāo)[20]。此外，其能快速地響應(yīng)土壤理化性質(zhì)的變化，并且直接參與了土壤生物化學(xué)轉(zhuǎn)化過(guò)程；也是土壤中植物有效養(yǎng)分的儲(chǔ)備庫(kù)，能促進(jìn)土壤養(yǎng)分的有效化，因此在土壤肥力和植物營(yíng)養(yǎng)中具有重要的作用。

由表3可以看出：當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間相同時(shí)，無(wú)論添加納米炭粉與否，1號(hào)土樣的微生物量碳含量均大于2號(hào)土樣，這與1號(hào)土樣的有機(jī)質(zhì)及養(yǎng)分含量較高有關(guān)。加入納米炭粉后，1號(hào)和2號(hào)土樣土壤微生物量碳含量均呈現(xiàn)波動(dòng)性變化趨勢(shì)。如1號(hào)土樣在第1天時(shí)除納米炭粉添加量為20.00 g/kg處理與對(duì)照無(wú)顯著差異外，其他納米炭粉處理均顯著大于對(duì)照；而培養(yǎng)第30天時(shí)除納米炭粉添加量為1.00 g/kg處理顯著大于對(duì)照組外，其余納米炭粉處理土壤微生物量碳含量均小于對(duì)照，且隨著添加量的增加而減小。表明納米炭粉作用初期對(duì)土壤微生物具有明顯的激活作用，這主要是由于納米炭粉具有一些特殊的性質(zhì)，可以提升土壤的保護(hù)容量，最終增加了土壤微生物活性。隨著納米炭粉添加量的增加，土壤微生物量碳含量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，除土樣2中的對(duì)照組外，其余納米炭粉處理第30天的微生物量碳含量均小于第1天。

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母者表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in each column mean significant difference atP<0.05.

2.3 納米炭粉對(duì)甲臜的吸附試驗(yàn)

由以上分析可看出，納米炭粉導(dǎo)致脫氫酶活性急劇降低，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用；而微生物量碳含量總體則呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。究其原因：一個(gè)可能是脫氫酶活性直接受到了抑制，另一個(gè)可能是脫氫酶活性測(cè)定方法受到了納米炭粉的干擾。為了驗(yàn)證上述2種可能，本研究進(jìn)行了脫氫酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物——甲臜與納米炭粉的吸附試驗(yàn)。

不同質(zhì)量濃度納米炭粉對(duì)甲臜的吸附結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，隨納米炭粉質(zhì)量濃度的增大，溶液中甲臜的含量逐漸減小，當(dāng)納米炭粉質(zhì)量濃度達(dá)到1.0，3.0 g/L時(shí)，甲臜含量分別為對(duì)照的 93.70% 和82.25%，降幅較??；當(dāng)納米炭粉質(zhì)量濃度達(dá)到15.0和30.0 g/L時(shí)，甲臜含量急劇減小，僅為對(duì)照的8.34%和0%。對(duì)溶液中甲臜含量(Y)與納米炭粉質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行擬合，結(jié)果為：Y=19.35-1.181×C，R2=0.999 5，表明納米炭粉強(qiáng)烈吸附了甲臜，揭示出采用TTC法測(cè)定土壤脫氫酶活性時(shí)，如果有納米炭粉等材料存在，將會(huì)使結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差，導(dǎo)致結(jié)果偏低，無(wú)法反映土壤的真實(shí)變化情況。據(jù)此可知，測(cè)定添加納米炭粉后土壤脫氫酶活性降幅較大的主要原因是納米炭粉的吸附作用。

目前，僅少數(shù)人指出在測(cè)試中納米材料本身對(duì)試驗(yàn)方法有一定影響，而小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)和介電限域效應(yīng)都是納米微粒和納米固體的基本特征，這一系列效應(yīng)導(dǎo)致納米材料在許多物理和化學(xué)方面都顯示出特殊的性能，勢(shì)必會(huì)對(duì)一些傳統(tǒng)的試驗(yàn)測(cè)定方法產(chǎn)生一定的影響。然而，在眾多的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料中，僅2006 年W?rle-Knirsch等[21]明確指出，采用不同方法比較單壁碳納米管對(duì)人上皮細(xì)胞的毒性時(shí)，出現(xiàn)了很多錯(cuò)誤的假陽(yáng)性結(jié)果。所以本試驗(yàn)中脫氫酶活性降低，是由于在納米炭粉存在條件下，土壤脫氫酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物被吸附而導(dǎo)致的假抑制現(xiàn)象。所以TTC法并不適合測(cè)定納米炭粉存在下的土壤脫氫酶活性研究。

圖2 不同質(zhì)量濃度納米炭粉對(duì)甲臜的吸附作用
Fig.2 Adsorption of TPF by nano carbon powders with different concentrations

3 討 論

綜上所述，由于納米炭粉具有特殊的理化性質(zhì)，在進(jìn)入土壤后，其對(duì)土壤中的微生物量碳含量影響較小，土壤微生物量碳含量略有增加；但在利用TTC法測(cè)定土壤脫氫酶活性變化時(shí)，由于碳納米顆粒有較強(qiáng)的吸附作用，導(dǎo)致土壤脫氫酶活性降低，上述2種結(jié)果是因?yàn)榧{米炭粉強(qiáng)烈地吸附了脫氫酶酶促反應(yīng)的產(chǎn)物——甲臜所致。故在研究碳納米顆粒環(huán)境效應(yīng)時(shí)，采用TTC法進(jìn)行脫氫酶研究是不適用的。

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Effects of nano carbon powder on activity of soil microorganism

ZHANG Jing1,DU Wei1,ZHAO Yi-ming1,HE Wen-xiang1，2

(1CollegeofResourceandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2KeyLaboratoryofPlantNutritionandtheAgri-environmentinNorthwestChina,MinistryofAgriculture,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to research the influence of nano carbon powder on soil dehydrogenase activity and microbial biomass carbon content.【Method】 Using indoor simulation,the changes of soil dehydrogenase activity and microbial carbon content were investigated by adding different amounts (0.00,1.00,3.00,5.00,10.00,and 20.00 g/kg) of nano carbon powder.The adsorption of TPF by nano carbon powders with different concentrations (0.0,1.0,3.0,4.5,7.5,15.0,and 30.0 g/L) was also analyzed to test whether TTC method was useful to detect dehydrogenase activity.【Result】 Compared with the CK,nano carbon powder decreased soil dehydrogenase activity and increased content of carbon in soil microorganism slightly to a stable level,indicating that nano carbon powder had weak activation effect on microorganism.The adsorption test showed that nano carbon powder had high adsorption performance,which quickly adsorbed TPF,caused low yield,and showed false inhibiting appearance of soil dehydrogenase activity.【Conclusion】 Nano carbon powder activated soil microbial activity.Using TTC method to analyze soil dehydrogenase with nano carbon powder was not reliable and future work is needed to find better method.

soil dehydrogenase;microorganism carbon;nano carbon powder;TTC

2013-12-27

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA101402)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(ZD2013012)；西北農(nóng)林科技大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目

張 晶(1989-)，女，陜西西安人，碩士，主要從事環(huán)境微生物研究。E-mail：greenwind1989@163.com

和文祥(1968-)，男，陜西黃龍人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事土壤生態(tài)毒理及土壤生物化學(xué)研究。 E-mail：wenxianghe@nwsuaf.edu.cn

時(shí)間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.016

S154.2

A

1671-9387(2015)06-0162-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.016.html