李同方，劉 霞，孫雪婧，杜曉華

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學 a 動物醫(yī)學院，b 生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

腦紅蛋白在成年牦牛腦中的表達研究

李同方1a,2，劉 霞1b,2，孫雪婧1a,2，杜曉華1a,2

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學 a 動物醫(yī)學院，b 生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

【目的】 探尋腦紅蛋白(Neuroglobin，NGB)在成年牦牛腦不同部位中的分布特征?！痉椒ā?選擇健康成年牦牛8只，宰殺后取其大腦皮質、小腦皮質、海馬、延髓、紋狀體及嗅球等部位的腦組織，利用免疫組織化學染色SP法和實時熒光定量PCR技術，對NGB在成年牦牛腦不同部位中的分布特征及定量關系進行觀察與檢測?！窘Y果】 NGB在成年牦牛腦不同區(qū)域的表達強弱有明顯差異，在大腦皮質中NGB基因的相對表達量(262.69±9.19)極顯著高于小腦皮質(137.00±7.29)、海馬(1.00±0.22)、延髓(3.43±0.76)、紋狀體(7.65±0.61)及嗅球(2.14±1.22)?！窘Y論】 NGB在成年牦牛腦不同部位中高表達，提示NGB在腦組織的氧利用及功能活動中發(fā)揮著重要作用。

腦紅蛋白；免疫組織化學；實時熒光定量PCR；牦牛

2000年，德國科學家Burmester等[1]在Nature上首次報道，在人和小鼠腦內存在一類新的、主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特異性攜氧球蛋白，稱為腦紅蛋白(Neuroglobin，NGB)。NGB的發(fā)現(xiàn)為腦缺氧的研究提供了新的思路。近年來，NGB已逐漸成為國內外學者研究的熱點[2-5]，但有關NGB作用的生理機制仍不明確。牦牛是分布于青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的牛種之一，對高寒低氧環(huán)境具有較強的適應性。由于NGB能夠可逆性地與氧結合，并且與氧的親和力很高，所以當血氧濃度較低時，NGB在轉運氧通過血腦屏障，提高腦組織氧的利用率方面發(fā)揮著重要作用[1]。目前，國內外對NGB組織分布的研究主要集中在人和嚙齒類動物[6-8]上，對于NGB在牦牛腦不同部位分布特征的研究尚未見報道。本試驗利用免疫組織化學染色SP法和實時熒光定量RT-PCR技術，對NGB在成年牦牛腦不同部位組織細胞中的分布特征及定量關系進行了觀察與檢測，以期為進一步研究NGB在腦組織中的生理功能提供重要的形態(tài)學資料，為探討牦牛高原適應性機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

從甘肅省甘南藏族自治州合作市屠宰廠采集8只健康成年牦牛(170～200 kg，雌雄各4只)的大腦皮質、小腦皮質、海馬、延髓、紋狀體和嗅球組織，迅速投入液氮和福爾馬林保存液中保存?zhèn)溆谩?/p>

兔抗鼠NGB多克隆抗體(bs-1859R)，購自博奧森生物技術有限公司(北京)；免疫組織化學染色試劑盒(sp-9001)及DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)，購自中杉金橋生物技術有限公司(北京)。RNA提取試劑盒，購自生工生物公司(上海)；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒，購自寶生物工程有限公司(大連)；RNase-Free ddH2O，購自天根生化科技有限公司(北京)。

1.2 NGB在牦牛腦中表達的免疫組化SP法檢測

1.2.1 組織切片制備 牦牛宰殺后，迅速取大腦皮質、小腦皮質、海馬、延髓、紋狀體、嗅球組織，置于體積分數(shù)4%的甲醛固定液中固定，18 h后，流水沖洗12 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作石蠟切片。

1.2.2 免疫組織化學染色 采用免疫組織化學SP法進行染色，步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度酒精水化，PBS(0.01 mol/L，pH=7.2，下文同) 沖洗3次，每次5 min；高壓條件下抗原修復2 min，室溫冷卻，PBS沖洗2次，每次3 min；體積分數(shù)3% H2O2水溶液封閉10 min，PBS沖洗3次，每次5 min；體積分數(shù)10%正常羊血清清蛋白孵育15 min后，傾去勿洗；每張片子滴加50 μL 1∶500倍稀釋的兔抗鼠NGB多克隆抗體，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗3次，除去PBS，每張切片滴加50 μL 1∶500倍稀釋的生物素標記山羊抗兔IgG工作液，37 ℃孵育15 min后，PBS沖洗3次，每次5 min；每張切片滴加50 μL辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min后，PBS沖洗3次，每次5 min；除去PBS，滴加新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下觀察并控制顯色；蒸餾水終止反應，蘇木精復染、脫水透明、中性樹膠封固。試驗同時設陰性對照組(以PBS替代一抗進行染色)。

1.3 NGB在牦牛腦中表達的熒光定量檢測

1.3.1 牦牛組織總RNA提取與反轉錄 用RNA提取試劑盒對大腦皮質、小腦皮質、海馬、延髓、紋狀體、嗅球組織總RNA進行提取，用紫外分光光度計檢測提取的RNA質量。按照反轉錄試劑盒說明書去除基因組中殘留的DNA后反轉錄為cDNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中牦牛NGB基因及β-actin基因序列進行引物設計，用Primer 3.0在線軟件設計特異性引物。引物序列及片段大小如表1所示。

用NCBI中的Primer-BLAST程序檢測引物本身不形成發(fā)夾結構，兩引物間不形成二聚體。擴增引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3.3 Real-time PCR反應 采用SYGB染料法檢測目的基因的相對表達量。在實時熒光定量儀MX3005P中進行擴增反應。反應條件控制如下：95 ℃ 預變性 10 min；95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，重復40個循環(huán);4 ℃保存。每種樣品重復3次，結果取平均值。反應結束后，由電腦自動得出熒光定量曲線。

1.3.4NGB在成年牦牛腦不同部位的表達檢測 NGB在成年牦牛腦不同部位表達量的檢測采用2-ΔΔCt定量方法分析[9-13]。本試驗分別選擇牦牛大腦皮質、小腦皮質、海馬、延髓、紋狀體及嗅球組織作為研究對象，以β-actin基因為對照內參基因，對NGB基因的表達進行定量研究，同時以海馬的定量結果作為參照。試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示,應用SPSS 16.0軟件計算重復樣品間Ct均值及標準偏差。

2 結果與分析

2.1 NGB在牦牛腦中表達的免疫組化結果

大腦皮質：NGB陽性細胞廣泛分布于大腦皮質的第Ⅰ～Ⅵ層，且數(shù)量眾多，NGB免疫陽性反應強度明顯高于小腦皮質、海馬、紋狀體、嗅球、延髓各區(qū)域(圖1)。其中，顳葉聽區(qū)、扣帶皮質、梨狀皮質中的陽性細胞較為密集，染色較強，陽性產(chǎn)物集中于細胞質。在大腦皮質額葉、顳葉、頂葉、枕葉等不同區(qū)域，NGB陽性表達強弱沒有明顯的差異。大腦髓質區(qū)域可見散在分布的NGB陽性細胞(圖1-A)。

小腦皮質：浦肯野氏細胞呈NGB強陽性表達，其細胞突起中也有較強的NGB陽性反應，與浦肯野氏細胞鄰近的一些神經(jīng)纖維中可見較弱的NGB陽性反應。分子層中的部分神經(jīng)細胞亦可見NGB陽性表達，但與浦肯野氏細胞相比，反應強度較弱。顆粒層中散在有NGB陽性表達細胞(圖1-B)。小腦皮質中，NGB陽性細胞免疫陽性反應強度較大腦皮質各區(qū)弱，但明顯強于海馬、紋狀體、嗅球、延髓各區(qū)域(圖1)。

海馬：NGB陽性細胞多為椎體細胞，反應部位主要存在于細胞突起中，強度較弱。在錐體細胞層外的其它區(qū)域內亦可見稀疏的NGB陽性細胞(圖1-C)。

紋狀體：在紋狀體的尾狀核區(qū)域，可見NGB陽性細胞廣泛分布，免疫陽性反應強度高于海馬、延髓、嗅球各區(qū)域，但較大腦皮質、小腦皮質各區(qū)域弱(圖1-D)。

嗅球：成年牦牛大腦嗅球的僧帽細胞層明顯，胞體大，染色呈NGB免疫陽性(圖1-E)。染色強度較延髓弱，但略高于海馬各區(qū)域。

延髓：NGB陽性細胞主要分布于灰質，白質中NGB陽性細胞亦有散在分布(圖1-F)。

2.2 NGB在牦牛腦中表達的熒光定量結果

2.2.1 總RNA的提取 利用RNA抽提試劑盒對牦牛腦不同部位的RNA進行提取，用分光光度計檢測所有樣品總RNA的OD260/OD280值均在1.8～2.0，表明RNA純度符合要求。

2.2.2 定量表達 (1)實時熒光定量RT-PCR擴增結果。在對提取的RNA進行反轉錄試驗后，首先設置溫度梯度對最佳退火溫度進行確定(一般選擇Ct值最小的退火溫度)，得到β-actin和NGB基因的最佳退火溫度均為60 ℃。最后將要分析的樣品(每種樣品3次重復)在同一檢測條件下進行反應得到β-actin和NGB基因的擴增曲線和熔解曲線(圖2，3)。

由圖2可見，β-actin和NGB基因的擴增曲線均呈現(xiàn)“S”形，說明各基因的動力學曲線平行性整體較好，曲線拐點清楚，基線平而無明顯上揚趨勢。熔解曲線(圖3)顯示各樣品熔解曲線集中。目的基因與內參基因的擴增產(chǎn)物的溫度值均一，表明在實時熒光定量PCR過程中，熒光強度均來自于特異性的擴增產(chǎn)物，目的基因及內參基因沒有產(chǎn)生非特異性擴增及引物二聚體。

(2)定量表達水平檢測。NGB基因在成年牦牛腦不同部位的表達量結果(表2)顯示，牦牛大腦皮質、小腦皮質、延髓、紋狀體及嗅球組織中NGB基因的表達量分別是海馬的262.69倍、137.00倍、3.43 倍、7.65倍和2.14倍，其中大腦皮質、小腦皮質NGB基因的表達量極顯著高于海馬、延髓、紋狀體及嗅球(P<0.01)，且大腦皮質NGB基因的表達量極顯著高于小腦皮質(P<0.01)；延髓、紋狀體及嗅球組織中NGB基因的表達量顯著高于海馬(P<0.05)，延髓、紋狀體及嗅球之間差異不顯著。

注：同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05),while different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

本試驗采用免疫組織化學染色SP法及實時熒光定量PCR技術對NGB在成年牦牛腦不同部位的分布和表達量進行了研究。結果顯示，NGB在成年牦牛腦不同部位中有廣泛的分布，數(shù)量多，表達強度高，提示腦紅蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中擔負著重要的功能。NGB參與神經(jīng)細胞對氧的攝取和儲存，能夠提高神經(jīng)細胞對氧的利用率[14]，在機體缺血缺氧條件下，NGB表達上調，可以對神經(jīng)細胞起到保護作用，提高腦組織對缺血缺氧的耐受度，進而減少腦組織的損傷[15]。對于長期生活在高原低氧環(huán)境中的牦牛，NGB在腦不同部位的表達對于增強牦牛神經(jīng)系統(tǒng)的氧利用率，維持腦的正常生理功能具有重要的意義。但是，NGB表達量的高低與其高原低氧環(huán)境的適應性是否存在必然的聯(lián)系還有待進一步的探討。

免疫組化結果顯示，NGB在成年牦牛腦中的分布存在較大差異，大腦皮質、小腦皮質中的免疫陽性反應明顯高于腦的其他部位，在腦內其他神經(jīng)核團中也可見較高強度的陽性表達。腦皮質及腦內神經(jīng)核團是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮功能的主要部位，對機體活動起著至關重要的作用[16]，NGB在牦牛腦皮質及功能核團中的高表達可能與其儲氧功能的發(fā)揮有著密切聯(lián)系，同時也反映出腦不同部位的活躍程度及耗氧量存在較大的差異。此外，NGB在牦牛腦其他部位和細胞中的分布也可能與該部位或此類細胞的耗氧性生理活動有關，但NGB是否還發(fā)揮其它的功能尚有待進一步的研究探討。

本試驗首次應用實時熒光定量PCR技術對NGB基因在牦牛腦內不同部位中的表達量進行了檢測。結果顯示，牦牛腦內不同部位中NGB基因的表達量有明顯差異，NGB在大腦皮質中的表達最強，這與Burmester等[1]用Northern雜交和原位雜交技術研究的結果相一致，也與王航雁等[17]在人和大鼠上的研究結果一致。本研究顯示，NGB基因在成年牦牛大腦不同區(qū)域的表達量有明顯差異，在大腦皮質的陽性表達量極顯著高于小腦皮質、海馬、延髓、紋狀體和嗅球，這一檢測結果與大腦不同區(qū)域對缺氧損傷的敏感性一致[18]。Zivin[19]研究表明，在缺血缺氧狀態(tài)下，NGBmRNA在腦內不同區(qū)域的表達程度與相應區(qū)域對缺血缺氧的敏感程度呈負相關；其中，大腦皮質對缺氧耐受時間為19.1 min，海馬為12.7 min，在缺氧狀態(tài)下，皮質中NGB基因的表達量為海馬的4倍。NGB基因在牦牛大腦皮質中的表達量最高，表明大腦皮質對缺血缺氧的敏感性最弱，耐受性最強。相反，NGB基因在牦牛海馬中的表達量最低，表明海馬對缺血缺氧的敏感性最強，耐受性最弱。本研究為NGB在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中生理功能的研究提供了新的理論依據(jù)。

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Distribution of neuroglobin in brain of adult yak

LI Tong-fang1a,2,LIU Xia1b,2,SUN Xue-jing1a,2,DU Xiao-hua1a,2

(1 aCollegeofVeterinaryMedicine,bCollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China;2GansuKeyLaboratoryofHerbivorousAnimalBiotechnology,Lanzhou,Gansu730070,China)

【Objective】 This study aimed to explore the localization of neuroglobin (Neuroglobin,NGB) in different areas of adult yak brain.【Method】 Eight health adult yaks were selected and NGB expression in different areas (cerebral cortex,cerebellar cortex,hippocampus,medulla oblongata,striaturn,and olfactory bulb) of adult yak brain was determined using the immunohistochemical SP technique and the real-time fluorescent quantitative PCR technology .【Result】 The expression of NGB in different areas of adult yak brain had significant difference.The relative expression ofNGBgene in cerebral cortex (262.69±9.19) was significantly higher than in cerebellar cortex (137.00±7.29),hippocampus (1.00±0.22),medulla oblongata (3.43±0.76),striaturn (7.65±0.61),and olfactory bulb (2.14±1.22).【Conclusion】 The expression of NGB in different areas of adult yak brain suggested that NGB might play an important role in utilization of oxygen and physiological functions.

neuroglobin;immunohistochemistry;real-time fluorescent quantitative PCR;yak

2014-01-01

甘肅省高等學校基本科研業(yè)務費項目(2013)；甘肅省教育廳研究生導師項目(1102-04)

李同方(1989-)，男，山東濟南人，碩士，主要從事動物解剖與組織胚胎學研究。E-mail：918403766@qq.com

杜曉華(1977-)，男，陜西米脂人，副教授，博士，主要從事動物解剖與組織胚胎學研究。E-mail：duxh@gsau.edu.cn

時間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.012

S823.8+51

A

1671-9387(2015)06-0001-06

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.012.html