陳 茜，邢玉娟，陳玉庫，胡元亮，王德云，蔡丙嚴

(1 南京農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，江蘇 南京210095；2 江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州225300)

黃芪多糖和氧化苦參堿協(xié)同增強雞新城疫疫苗免疫效果研究

陳 茜1，邢玉娟2，陳玉庫2，胡元亮1，王德云1，蔡丙嚴2

(1 南京農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，江蘇 南京210095；2 江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州225300)

【目的】 研究黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)和氧化苦參堿(Oxymatrine,OM)對新城疫疫苗免疫的影響?！痉椒ā?將14 日齡非免疫羅曼蛋公雞550 羽隨機均分為11 組，1～9組分別為OAP(以OM與APS質量比為6∶4配成)、OM和APS的高(4 mg/mL)、中(2 mg/mL)、低(1 mg/mL)劑量組，10組為免疫對照組，11組為空白對照組。除空白對照組外，各組試驗雞只均于14日齡首免NDV-Ⅳ系疫苗，28日齡重復免疫。在首次免疫的同時，1～9 組分別口服高、中、低劑量藥物，免疫對照組和空白對照組口服等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)3 d。分別于14，21，28，35和42 日齡采血，用MTT法測定T淋巴細胞增殖的變化，用β-微量法測定血清抗體效價變化。于14，21，28和35 日齡，每組隨機抽取雞4 羽，稱體質量，剖殺，摘取法氏囊和脾臟并稱質量，計算免疫器官指數(shù)?！窘Y果】 OAP、OM、APS高、中劑量在各時間點均能促進T淋巴細胞增殖；OAP高、中劑量組在各時間點抗體效價顯著高于免疫對照組；OAP高、中、低劑量組在各時間點的脾指數(shù)和法氏囊指數(shù)均顯著高于免疫對照組(OAP低劑量組35日齡除外)?！窘Y論】 黃芪多糖和氧化苦參堿能協(xié)同增強雞新城疫疫苗的免疫效果。

中藥成分復方；T淋巴細胞增殖；抗體效價；免疫器官指數(shù)

研究證明，中藥及其主要成分作為一種免疫增強劑，具有來源廣泛、效果顯著、無毒副作用等優(yōu)勢，不僅能克服油乳類、鋁膠類化學佐劑副作用大，局部刺激重、致癌、制備和使用麻煩或不足以提高弱抗原的免疫原性等弊病[1-4]，而且能顯著增強機體的細胞免疫和體液免疫功能，促進免疫器官的發(fā)育和細胞因子的分泌[5-6]。

在前期研究中，筆者所在研究團隊發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)與氧化苦參堿(Oxymatrine,OM)等中藥成分具有顯著抑制新城疫病毒(Newsastle disease virus,NDV)增殖的作用[7]；中藥成分復方在攻毒前、與攻毒同時和攻毒后給藥均能顯著降低受試雞的死亡率，提高血清NDV抗體效價，減輕死亡雞的器官出血[8]，但對于其增強免疫作用機理的研究尚未見報道。

本試驗在前期研究基礎上，進一步測定了中藥成分及其復方對新城疫苗免疫后雛雞外周血T淋巴細胞增殖、血清抗體效價、法氏囊指數(shù)和脾指數(shù)的影響，進一步探討中藥成分復方增強免疫的作用機理，以期為研制中藥成分免疫增強劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥物準備 根據以前的試驗結果[5-6]，分別用雙蒸水將OM、APS和OM-APS(OAP，以OM與APS質量比為6∶4配成)配制成高(4 mg/mL)、中(2 mg/mL)、低(1 mg/mL) 3 種質量濃度的溶液，常規(guī)消毒后備用。

1.1.2 疫苗和病毒 新城疫Ⅳ系(Newcastle disease virus Ⅳ strain，NDV-Ⅳ)疫苗，中牧股份南京藥械廠生產，批號753-3。新城疫檢測抗原，由南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院中獸醫(yī)研究室提供。新城疫強毒E01株，由江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所禽病研究室提供。將病毒按常規(guī)方法接種9 日齡SPF雞胚，恒溫培養(yǎng)72 h，收獲尿囊液，按Reed-Muench法[9]測定雞胚半數(shù)感染量(Egg infectious dose,EID50)為10-8.83。

1.1.3 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司產品，按說明書用三蒸水配制后過濾除菌，分裝，4 ℃保存，臨用前加入犢牛血清達體積分數(shù)5%，同時加青霉素、鏈霉素各100 IU/mL；植物血凝素(PHA)，上海伊華科技有限公司產品，用RPMI1640培養(yǎng)液配制成0.1 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后-20 ℃保存；四甲基偶氮唑藍(MTT)溶液，Amresco公司產品，用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，使最終質量濃度為5 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后4 ℃冰箱避光保存；淋巴細胞分離液，上海恒信化學試劑有限公司產品；淋巴細胞裂解液二甲基亞砜(DMSO)，分析純，蘇州正興化工研究院產品。

1.1.4 試驗動物 1 日齡非免疫健康羅曼蛋公雞600羽，購自湯泉農墾種雞場。試驗期間采用籠養(yǎng)，全價飼料，自由采食和飲水，1～14 日齡采用紅外燈保溫，全日制光照。

1.2 試驗設計

雛雞飼養(yǎng)至14 日齡(平均體質量95 g/只)，平均母源抗體效價3.3時，隨機選取550羽均分為11 組。第1～9 組為OAP高(OAPH)、OAP中(OAPM)、OAP低(OAPL)、OM高(OMH)、OM中(OMM)、OM低(OML)、APS高(APSH)、APS中(APSM)和APS低(APSL)，第10組為疫苗對照組，第11 組為空白對照組隔離飼養(yǎng)。除空白對照組外，其他組試驗雞于14日齡首免，用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、點眼免疫，每羽1 羽份；28 日齡時重復免疫。在首次免疫的同時，3 個中藥復方組分別口服高、中、低劑量的OAP復方，每羽1 mL，6 個單味藥組分別口服高、中、低劑量的OM和APS，每羽1 mL，免疫對照組和空白對照組口服等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)3 d。分別于14，21，28，35和42 日齡，每組隨機取雞4 羽，無菌心臟采血(4.0 mL/羽)，肝素抗凝，測定外周血淋巴細胞增殖；每組隨機另取雞10 羽翼靜脈采血，分離血清，用β-微量法測定HI抗體效價。在14，21，28和35 日齡，每組隨機取雞4 羽，稱體質量，剖殺，摘取法氏囊和脾臟并稱其質量，計算免疫器官指數(shù)(免疫器官質量/體質量×100%)。

1.3 淋巴細胞增殖的測定

采用MTT法[10]，將抗凝血樣用Hank’s液稀釋1 倍，小心加在淋巴細胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，吸取中間云霧狀白細胞層，用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗2 遍，1 500 r/min離心15 min。臺盼藍染色，細胞計數(shù)活細胞大于90%后，用RPMI1640培養(yǎng)液調整細胞密度為2.5×106個/mL，加入到96 孔細胞培養(yǎng)板(德國Nunclon公司生產)中，80 μL/孔，每孔再加20 μL PHA，每個樣品重復4 孔，然后置于39.5 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下(CO2培養(yǎng)箱，美國Revco公司產品)培養(yǎng)44 h，然后每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加裂解液100 μL，將細胞板置于微量振蕩器(75-2A型，上海醫(yī)用分析儀器廠生產)上振蕩5 min使沉淀完全溶解，在酶聯(lián)免疫儀(DG-3022型，中國華東電子管廠生產)上于570 nm處檢測吸光值(A570)作為T淋巴細胞增殖的指標。

1.4 抗體效價的測定

在96孔微量血凝板上，從左到右每孔各加50 μL PBS液，再向每排的第1 孔加入50 μL待檢血清，依次向后倍比稀釋直至第12 孔，然后向每孔加入50 μL 4 單位抗原，在微量振蕩器上振蕩混勻后置于溫箱中感作20 min。取出血凝板向每孔加入50 μL 雞紅細胞懸液，同時設陽性血清、陰性血清及空白對照孔。振蕩混勻后置于37 ℃溫箱中感作30 min，待對照孔紅細胞已經沉淀時觀察結果[9]。

1.5 數(shù)據處理

淋巴細胞A570值、HI效價和免疫器官指數(shù)以“平均值±標準差”表示。用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，比較各時間點淋巴細胞轉化、抗體效價和免疫器官指數(shù)的差異性。

2 結果與分析

2.1 OM、ASP和OAP對雞淋巴細胞增殖的影響

OM、ASP、OAP不同劑量和免疫對照組各時間點A570值均顯著高于空白對照組(P<0.05)；與免疫對照組相比較，OAPH、OAPM、OMH、OMM、APSH、APSM在各時間點，OAPL、APSL在21，28，35和42日齡，OML在21，28和42日齡的A570值顯著升高(表1)。

OAPH在各時間點A570值均顯著高于OMH和APSH(P<0.05)；OAPM在28日齡A570值高于APSM，但差異不顯著，其余各時間點其A570值均顯著高于OMM和APSM(P<0.05)；不同劑量復方組和OMH、APSH在21 日齡A570值達到高峰，其余各單味藥及對照組在28 日齡達到高峰(表1)。

注：同列數(shù)據后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05).The same below.

2.2 OM、ASP和OAP對雞抗體效價的影響

由表2可知，OM、ASP、OAP各劑量組和免疫對照組試驗雞各時間點抗體效價均顯著高于空白對照組(P<0.05)；OAPH和OAPM在14～42日齡，APSM和OMM在21～42日齡，APSH在21,35，42日齡,OAPL在21，28，35日齡，APSL、OMH在21日齡抗體效價顯著高于免疫對照組(P<0.05)。

OAPH的抗體效價在各時間點均顯著高于OMH和APSH(P<0.05)；OAPM抗體效價在21，28，35和42 日齡顯著高于OMM，在21，28和35 日齡顯著高于APSM(P<0.05)；OAPL抗體效價在28 日齡顯著高于OML(P<0.05)(表2)。

2.3 OM、ASP和OAP對雞免疫器官指數(shù)的影響

2.3.1 法氏囊指數(shù)的變化 由表3可知，OAPL、OMH、OML、免疫對照組和空白對照組的法氏囊指數(shù)在21 日齡達到峰值，其他各組在28 日齡達到峰值；各藥物組及免疫對照組法氏囊指數(shù)均顯著高于空白對照(P<0.05)；OAPH、OAPM、OMM、OML、APSH、APSM、APSL在各時間點，OMH在21和28日齡及OAPL在14，21和28日齡法氏囊指數(shù)顯著高于免疫對照組(P<0.05)。OAPH的法氏囊指數(shù)在各時間點均顯著高于OMH，在28和35 日齡顯著高于APSH，OAPM的法氏囊指數(shù)在35 日齡顯著高于OMM和APSM(P<0.05)。

2.3.2 脾指數(shù)的變化 由表4可知，OAP各劑量組、OMM、APSH、APSM在各時間點、OMH在14和35日齡、OML和APSL在14，21和35日齡脾指數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)；OAP各劑量組、OMM、APSH、APSM在各時間點及OML在21日齡和APSL在14，21 日齡的脾指數(shù)均顯著高于免疫對照組(P<0.05)。

OAPH在各時間點的脾指數(shù)均顯著高于OMH；OAPM在21，28和35 日齡的脾指數(shù)顯著高于OMM，在28 日齡顯著高于APSM；OAPL在14和28 日齡脾指數(shù)顯著高于OML(表4)。

3 討 論

3.1 中藥成分復方及其組分藥對淋巴細胞增殖的影響

淋巴細胞增殖是反映機體細胞免疫水平的一個重要指標[11]。細胞免疫是通過致敏淋巴細胞與相應抗原作用而發(fā)揮抗病原體感染、抗腫瘤、幫助B淋巴細胞產生抗體等作用。本試驗結果表明，9 個試驗藥物組中，除OAPL、OML、APSL在14 日齡，OML在35 日齡A570與免疫對照組無顯著差異外，其余各組在各時間點的A570值均顯著高于免疫對照組。提示OAP、APS和OM在合適的劑量均能刺激淋巴細胞增殖，促進細胞免疫，且以OAPM、OAPH的效果最好。

3.2 中藥成分復方及其組分藥對新城疫苗免疫應答的影響

血清抗體效價反映機體體液免疫狀態(tài)[12]，體液免疫是機體抗御感染的主要因素之一，通過抗原-抗體結合反應而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多種作用。本試驗結果表明，OAPH、OAPM在5個時間點、OMM和APSM在4 個時間點、OAPL和APSH在3 個時間點、OMH和APSL在1 個時間點的抗體效價均顯著高于免疫對照組。表明OAP、APS和OM在合適的劑量均能刺激抗體產生，提高機體體液免疫水平，其中以OAPH、OAPM和APSM的作用較強。

3.3 中藥成分復方及其組分藥對免疫器官指數(shù)的影響

一般認為，免疫器官指數(shù)降低為免疫抑制所致，而免疫器官指數(shù)增加則為免疫增強的表現(xiàn)[13]。本試驗中，OAPH、OAPM在各時間點的法氏囊指數(shù)、脾指數(shù)均顯著高于免疫對照和空白對照組，OAPL在14，21和28 日齡的法氏囊指數(shù)和各時間點的脾指數(shù)顯著高于免疫對照組。除OMH在14和35 日齡以及OAPL在35 日齡的法氏囊指數(shù)高于免疫對照組但差異不顯著外，其余各藥物組法氏囊指數(shù)均顯著高于免疫對照組。在脾指數(shù)方面，OMH在各時間點，OML在14，28和35 日齡，APSL在28和35 日齡與免疫對照組無顯著差異，其余各組、各時間點均顯著高于免疫對照組。表明中藥成分復方及其組分藥能增加免疫器官質量，從而增強機體的免疫功能。

3.4 中藥成分復方及其組分藥增強免疫作用的量效關系

本試驗發(fā)現(xiàn)，OAP增強免疫作用有一定的量效關系。在促進T淋巴細胞增殖方面，OAPH、OAPM在各時間點均顯著高于免疫對照組，而OAPL在14 日齡與免疫對照組無顯著差異。OM和APS的高、中劑量組各時間點的A570值與免疫對照組相比較差異顯著，而低劑量組在14 日齡與免疫對照組無顯著差異，這可能是因為劑量過小，不足以刺激機體產生致敏淋巴細胞所致，具體原因還有待于進一步研究；在提高血清抗體效價方面，OAPH、OAPM在各個時間點均顯著高于免疫對照組；OAPL在21，28和35 日齡顯著高于免疫對照組。在提高法氏囊指數(shù)方面，OAPH、OAPM各時間點的法氏囊指數(shù)顯著高于免疫對照組；OAPL在14，21和28 日齡顯著高于免疫對照組，在35 日齡與免疫對照組相比較差異不顯著。Kong等[14]在觀察9種中藥成分對新城疫Ⅳ系疫苗免疫雛雞血清中血凝抑制抗體水平影響的研究中，也得到了類似結果。

3.5 中藥成分復方與其單味組分藥增強免疫作用的比較

在促進T淋巴細胞增殖方面，OAPH的A570值顯著高于OMH和APSH；在提高血清抗體效價方面，OAPH抗體效價顯著高于OMH和APSH；在提高免疫器官指數(shù)方面，OAPH的法氏囊指數(shù)顯著高于OMH。OAP是由OM和APS組成的復方，其增強免疫作用優(yōu)于單味組分藥，表明兩種組分藥有協(xié)同作用。王德云等[15-16]在研究當歸多糖、黃芪多糖、淫羊藿多糖、蜂膠黃酮等提高免疫調節(jié)作用時亦發(fā)現(xiàn)，中藥成分復方的免疫活性優(yōu)于其單味組分。

綜合以上結果可見，OAP能顯著增強雛雞對新城疫疫苗的免疫應答，且中、高劑量的效果較好，顯著優(yōu)于單味組分，可作為新型免疫增強劑的候選方。

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Increasing immune efficacy of Newcastle disease vaccine in chicken by astragalus polysaccharide and oxymatrine

CHEN Xi1,XING Yu-juan2,CHEN Yu-ku2,HU Yuan-liang1,WANG De-yun1,CAI Bing-yan2

(1CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu210095,China;2JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege,Taizhou,Jiangsu225300,China)

【Objective】 This paper aimed to study the immune effect of astragalus polysaccharide (APS) and oxymatrine (OM) on Newcastle disease vaccine.【Method】 Five hundred and fifty 14-day-old non-immunized Roman cocks were randomly divided into 11 groups.Groups 1 to 9 were OAP (OM and APS quality ratio of 6∶4),OM and APS at high (4 mg/mL),medium (2 mg/mL) and low (1 mg/mL) doses,respectively.Group 10 was vaccine control and group 11 was blank control.Groups 1 to 10 were vaccinated with NDV-Ⅳ at the ages of 14 and 28 days,respectively.At the same time of the first vaccination,the chickens in groups 1 to 9 were given compounds at high,medium and low doses and chickens in vaccination and blank control groups were given physiological saline by oral administration,once a day for three days. On days 14,21,28,35 and 42,peripheral T lymphocyte proliferations and serum antibody titers were determined with MTT method and β-microscopic method,respectively.On 14,21,28 and 35 days,the organ indexes of spleen and bursa were determined by killing 4 chickens in each group.【Result】 T lymphocyte proliferations were promoted by OAP,OM and APS at high and medium doses and serum antibody titers of OAP at high and medium doses were significantly higher than those of vaccine control group.At any time,spleen and bursa indexes of OAP at all doses were significantly higher than those of vaccine control group (except the OAP low dose group for 35-day old chicken).【Conclusion】 APS and OM could synergistically improve the immune efficacy of Newcastle disease vaccine in chicken.

Chinese herbal medicinal ingredients compounds;T lymphocyte proliferation;antibody titer;immune organ index

2014-05-27

國家科技支撐計劃項目(2008BADB4B06)；國家大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目(2013110307038)

陳 茜(1992-)，女，內蒙古通遼人，本科在讀，主要從事中獸藥藥理學研究。E-mail：1903048596@qq.com

胡元亮(1953-)，男，江蘇邳州人，教授，博士，博士生導師，主要從事中獸醫(yī)學研究。E-mail：ylhu@njau.edu.cn

時間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.028

S853.7

A

1671-9387(2015)06-0041-06

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.028.html