隋宥珍，劉連為,2，陳新軍

（1.農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)漁場(chǎng)漁業(yè)資源科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.浙江海洋學(xué)院，浙江舟山 316022；3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306）

三種柔魚類SSR標(biāo)記的通用性檢測(cè)

隋宥珍1，劉連為1,2，陳新軍3

（1.農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)漁場(chǎng)漁業(yè)資源科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.浙江海洋學(xué)院，浙江舟山 316022；3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306）

分析了柔魚、阿根廷滑柔魚、莖柔魚3種柔魚類多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記在種間的通用性。結(jié)果表明，柔魚與莖柔魚多態(tài)性SSR標(biāo)記在阿根廷滑柔魚中不適用，同樣，阿根廷滑柔魚多態(tài)性SSR標(biāo)記在二者中也不適用。柔魚3個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記（位點(diǎn)Bo101、Bo106、Bo1018）在莖柔魚DNA樣本中擴(kuò)增時(shí)顯示出單態(tài)性，而莖柔魚10個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記在柔魚中具有較好的適用性。10個(gè)SSR位點(diǎn)（DG01、DG04、DG10、DG13、DG19、DG28、DG37、DG38、DG40、DGI8）等位基因數(shù)為4～44個(gè)，觀測(cè)雜合度介于0.350～0.950之間，期望雜合度介于0.615～0.972之間。多態(tài)信息含量介于0.525～0.959之間，均為高度多態(tài)性位點(diǎn)（PIC＞0.5）。經(jīng)Bonferroni校正后，位點(diǎn)DG01、DG19極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01）。柔魚群體的平均等位基因數(shù)、平均觀測(cè)雜合度、平均期望雜合度、多態(tài)信息含量分別為13.40、0.631、0.814、0.723，顯示出較高的遺傳多樣性水平。由此可見，莖柔魚類多態(tài)性SSR標(biāo)記在柔魚中具有較高的通用性。

柔魚；阿根廷滑柔魚；莖柔魚；微衛(wèi)星標(biāo)記；通用性

頭足類被認(rèn)為是世界海洋漁業(yè)資源中3種未充分開發(fā)利用的種類之一，其中規(guī)模性開發(fā)的種類中以柔魚類所占比重最大，主要包括太平洋褶柔魚Todarodes pacificus、柔魚Ommastrephes batramii、雙柔魚Nototodarus sloani、阿根廷滑柔魚 Illex argentinus、莖柔魚 Dosidicus gigas、鳶烏賊 Symplectoteuthis oualaniensis等[1-2]。目前，柔魚、阿根廷滑柔魚、莖柔魚已成為我國(guó)遠(yuǎn)洋魷魚釣的主要捕撈對(duì)象①上海海洋大學(xué)魷釣技術(shù)組。2002-2013年我國(guó)魷釣船柔魚、阿根廷滑柔魚、莖柔魚生產(chǎn)總結(jié)。。柔魚、阿根廷滑柔魚、莖柔魚分別隸屬于柔魚科中的柔魚屬Ommastrephes、滑柔魚屬Illex與莖柔魚屬Dosidicus，資源豐富且分布廣泛，有關(guān)其種群遺傳學(xué)研究已有大量報(bào)道[3-8]。其中，微衛(wèi)星simple sequence repeat，SSR標(biāo)記由于具有高度多態(tài)性、共顯性、實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而得以廣泛應(yīng)用[6-8]。目前，3種柔魚類SSR標(biāo)記均已開發(fā)出，但柔魚與阿根廷滑柔魚多態(tài)性SSR標(biāo)記數(shù)目較少，仍需開發(fā)出更豐富的多態(tài)性SSR標(biāo)記，以便更好地揭示其在全球分布范圍內(nèi)的遺傳背景。由于SSR側(cè)翼序列在近緣物種間較為保守，因此，采用近緣物種轉(zhuǎn)移法是獲得SSR標(biāo)記的簡(jiǎn)便、快速的方法[9]。為此，本文分析了3種柔魚類多態(tài)性SSR標(biāo)記在種間的通用性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與基因組DNA的提取

柔魚、阿根廷滑柔魚與莖柔魚捕獲后立刻剪取尾鰭肌肉組織保存于95%乙醇中，存放于船艙冷庫中并運(yùn)回至實(shí)驗(yàn)室。分別選取40個(gè)個(gè)體用于SSR標(biāo)記的通用性檢測(cè)，柔魚樣本采自西北太平洋海域（40°41′-42°34′N、149°29′-155°10′E），阿根廷滑柔魚樣本采自阿根廷專屬經(jīng)濟(jì)區(qū)以外海域（45°17′-47°20′S、60° 16′-60°49′W），莖柔魚樣本采自赤道海域（3°N-5°S、114°-120°W）。采用Genomic DNA Isolation Kit（福際生物技術(shù)有限公司）提取基因組DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。

1.2 微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增

柔魚8對(duì)SSR引物引自劉連為等[6]（位點(diǎn)：Bo101～Bo108），莖柔魚28對(duì)SSR引物引自Liu等[10]（位點(diǎn)：DG01、DG04～DG11、DG13～DG16、DG18～DG21、DG26、DG28～DG30、DG34、DG36～DG40、DGI8），阿根廷滑柔魚7對(duì)SSR引物引自Adock等[11]（位點(diǎn)：Ia112、Ia121a、Ia121b、Ia203、Ia207、Ia408、Ia422）。SSR引物及熒光標(biāo)記SSR引物由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。首先利用普通SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳初步篩選出能夠擴(kuò)增出清晰條帶的SSR標(biāo)記。然后用帶有熒光標(biāo)記的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過基因分型技術(shù)篩選多態(tài)性SSR標(biāo)記。PCR反應(yīng)總體積均為25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL、Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.2 μL、dNTP（各2.5 mmol/L）2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL、DNA模板20 ng、ddH2O補(bǔ)足體積。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸2 min。

1.3 PCR產(chǎn)物的純化及其分子量數(shù)據(jù)的讀取

帶有熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Biospin Gel Extraction Kit純化后，送至上海邁浦生物科技有限公司。PCR產(chǎn)物稀釋后與分子量?jī)?nèi)標(biāo)（ROX-500）混合，通過ABI3730XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)血管電泳，利用Genemapper Version 3.5軟件讀取微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)分子量數(shù)據(jù)確定個(gè)體各位點(diǎn)基因型，利用Popgen 3.2[12]進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，計(jì)算等位基因數(shù)（Na），有效等位基因數(shù)（Ne），觀測(cè)雜合度（Ho），期望雜合度（He）與Shannon多樣性指數(shù)（Shannon's information index，I）。多態(tài)信息含量（PIC）由Cervus 3.0[13]軟件計(jì)算，并采用馬爾科夫鏈（Markov Chain）方法進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，阿根廷滑柔魚7對(duì)SSR引物在柔魚、莖柔魚DNA樣本中均未擴(kuò)增出任何條帶；柔魚8對(duì)SSR引物在阿根廷滑柔魚DNA樣本中未擴(kuò)增出任何條帶，而在莖柔魚DNA樣本中有3對(duì)引物擴(kuò)增出清晰條帶；莖柔魚28對(duì)SSR引物在阿根廷滑柔魚DNA樣本中未擴(kuò)增出任何條帶，而在柔魚DNA樣本中有15對(duì)引物擴(kuò)增出清晰條帶。用帶有熒光標(biāo)記的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過等位基因分型技術(shù)進(jìn)一步篩選多態(tài)性SSR標(biāo)記。其中，在莖柔魚DNA樣本中擴(kuò)增出清晰條帶的柔魚 3個(gè)位點(diǎn)（Bo101、Bo106、Bo108）為單態(tài)性位點(diǎn)；在柔魚DNA樣本中擴(kuò)增出清晰條帶的莖柔魚 5個(gè)位點(diǎn)（DG08、DG11、DG18、DG29、 DG36）為單態(tài)性位點(diǎn)，10個(gè)位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn)（表1）。圖1為位點(diǎn)DG40 PCR擴(kuò)增的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果。

圖1 莖柔魚位點(diǎn)DG40對(duì)柔魚PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification in Ommastrephes bartramii by locus DG40 from Dosidicus gigas

莖柔魚10對(duì)SSR引物的核心序列、擴(kuò)增產(chǎn)物大小、退火溫度以及SSR位點(diǎn)在柔魚群體中的擴(kuò)增結(jié)果見表1。各位點(diǎn)等位基因數(shù)為4～44個(gè)，觀測(cè)雜合度介于0.350～0.950之間，期望雜合度介于0.615～0.972之間。多態(tài)信息含量介于0.525～0.959之間，均為高度多態(tài)性位點(diǎn)（PIC＞0.5）。經(jīng)Bonferroni校正后，位點(diǎn)DG01、DG19極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01）。柔魚群體的平均等位基因數(shù)、平均觀測(cè)雜合度、平均期望雜合度、多態(tài)信息含量分別為13.40、0.631、0.814、0.723，顯示出較高的遺傳多樣性水平。

3 討論

獲得SSR標(biāo)記有多種方法，常見方法為磁珠富集法和基于第二代測(cè)序技術(shù)的基因組測(cè)序或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，如上文提到的柔魚與莖柔魚SSR標(biāo)記的開發(fā)[6,10]。而獲得SSR標(biāo)記的簡(jiǎn)便、快速的方法為檢索Gen－Bank、EMBL、DDBJ等DNA序列數(shù)據(jù)庫，或者利用親緣性較近的物種的SSR標(biāo)記。作者利用基因組測(cè)序方法獲得莖柔魚39個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記，并應(yīng)用于東南太平洋莖柔魚群體遺傳學(xué)研究，而通過磁珠富集法從柔魚部分微衛(wèi)星富集文庫中篩選出8個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記以及已報(bào)道的阿根廷滑柔魚多態(tài)性SSR標(biāo)記僅8個(gè)，均不能滿足其群體遺傳學(xué)研究[6,10,11]。本文采用近緣物種轉(zhuǎn)移法分析了3種柔魚類多態(tài)性SSR標(biāo)記在種間的通用性。結(jié)果表明，柔魚與莖柔魚SSR標(biāo)記在阿根廷滑柔魚中不適用，同樣，阿根廷滑柔魚SSR標(biāo)記在二者中也不適用。莖柔魚SSR標(biāo)記在柔魚中具有較好的適用性，而柔魚3個(gè)SSR標(biāo)記在莖柔魚DNA樣本中擴(kuò)增時(shí)顯示出單態(tài)性，這可能與選擇的柔魚SSR標(biāo)記數(shù)量太少有關(guān)。柔魚與莖柔魚隸屬于柔

魚亞科（Ommastrephinae），而阿根廷滑柔魚隸屬于滑柔魚亞科（Illicinae），它們?cè)诜诸惖匚簧系牟町惪赡茉斐煞N間SSR標(biāo)記適用性的差異。在今后的研究中，可將莖柔魚多態(tài)性SSR標(biāo)記用于柔魚的群體遺傳學(xué)研究。

表1 莖柔魚SSR 標(biāo)記特征及其對(duì)柔魚中的通用性Tab.1 Characterization of microsatellite markers derived from D. gigas and their transferability in O. bartramii

位點(diǎn)DG01、DG19極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡（P<0.01），且它們均存在純合體個(gè)體過?，F(xiàn)象。因此，這2個(gè)位點(diǎn)很可能存在無效等位基因（null allele）。無效等位基因產(chǎn)生的原因主要為SSR側(cè)翼序列變異，從而導(dǎo)致該位點(diǎn)無法正常擴(kuò)增，電泳檢測(cè)時(shí)無可見的擴(kuò)增條帶或者雜合子只表現(xiàn)出一條帶[14]。建議在以后的實(shí)驗(yàn)中可通過重新設(shè)計(jì)特異性SSR引物從根本上消除無效等位基因的影響或者估算無效等位基因頻率進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究。

[1]陳新軍,陸化杰,劉必林,等.大洋性柔魚類資源開發(fā)現(xiàn)狀及可持續(xù)利用的科學(xué)問題 [J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,21(5): 831-840.

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Cross-species Amplifiation of Microsatellite Markers in Three Ommastrephidae Species

SUI You-zhen1，LIU Lian-wei1,2，CHEN Xin-jun3
(1.Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources for Key Fishing Grounds,MOA,Key Laboratory of Sustainable Utilization of Technology Research for Fisheries Resources of Zhejiang Province, Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021;2.Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022;3.The Key Laboratory of Sustainable Exploitation of Oceanic Fisheries Resources, Ministry of Education,College of Marine Sciences,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

The transferability of polymorphic short sequence repeats(SSRs)from Ommastrephes bartramii, Illex argentinus and Dosidicus gigas was assessed in the three closely-related species.A population of 40 individuals of each Ommastrephidae species were tested with 7 loci from I.argentinus,8 loci from O.bartramiiand 28 loci from D.gigas.The results showed that all the loci from I.argentinus failed to be amplified in O. bartramii and D.gigas,while all the loci from O.bartramii and D.gigas failed to be amplified in I.argentinus. Three loci(Bo101,Bo106 and Bo1018)from O.bartramii were monomorphic in D.gigas,and 10 loci(DG01, DG04,DG10,DG13,DG19,DG28,DG37,DG38,DG40 and DGI8)from D.gigas were polymorphic in O.bartramii.The number of alleles per polymorphic locus ranged from 4 to 44(mean=13.40)in these 10 loci,and the observed and expected heterozygosity ranged from 0.350 to 0.950(mean=0.631)and from 0.615 to 0.972 (mean=0.814),respectively.Two loci(DG01,DG19)deviated significantly from the HWE test after Bonferroni correction(P<0.05),and the polymorphism information content(PIC)of 10 loci ranged from 0.525 to 0.959 (mean=0.723),which indicated all the loci were highly polymorphic.From this we can see that these 10 loci from D.gigas are expected to be useful for further studies of genetic diversity of O.bartramii.

Ommastrephes bartramii;Illex argentinus;Dosidicus gigas;microsatellite markers;crossspecies amplifiation

S917.4

A

1008－830X(2015)06－0532－05

2015-09-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（41276156）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA092303）；上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃（12231203900）

隋宥珍（1983-），女，遼寧大連人，研究方向：分子生態(tài)學(xué).E-mail：shuichansui@126.com

陳新軍，男，教授.E-mail：xjchen@shou.edu.cn