左曉佳，鄭文新，托乎提·阿及德，毛瓊玲，肖海霞

（1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，新疆 烏魯木齊 830000 2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，新疆 烏魯木齊 830000）

結(jié)合雌激素純化及組分分析研究進(jìn)展

左曉佳1，鄭文新1，托乎提·阿及德2，毛瓊玲1，肖海霞2

（1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，新疆 烏魯木齊 830000 2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，新疆 烏魯木齊 830000）

從孕期馬尿中提取出的雌激素代謝產(chǎn)物稱為結(jié)合雌激素，臨床上可用于治療多種雌激素缺乏所導(dǎo)致的更年期癥狀。近一個(gè)世紀(jì)對(duì)其的研究取得了較多成果，本文對(duì)其分離純化方法，組分及化學(xué)結(jié)構(gòu)分析的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)該領(lǐng)域有待進(jìn)一步深入研究的方面做了展望。

結(jié)合雌激素；孕馬尿；分離純化；組分鑒定；

結(jié)合雌激素（conjugated estrogen hormone;conjugated estrogens，簡(jiǎn)稱CE;）是對(duì)最早從孕馬尿中提取的，多種天然固醇類水溶性結(jié)合態(tài)雌激素混合物的統(tǒng)稱。經(jīng)過(guò)多年對(duì)激素代謝的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素在哺乳動(dòng)物體內(nèi)是以膽固醇為起始物，經(jīng)孕醇酮，雄烯二酮，睪酮等多種中間產(chǎn)物，最終形成雌二醇[1]。在體內(nèi)代謝過(guò)程中，經(jīng)過(guò)多種酶的作用經(jīng)過(guò)羥基化、羥基脫氫氧化、羥基硫酸酯化等一系列中間反應(yīng)形成多種中間產(chǎn)物參與動(dòng)物體內(nèi)不同的生理反應(yīng)，最終以葡萄糖苷酸，硫酸鹽的結(jié)合形式隨尿液排出體外。經(jīng)過(guò)近八十年的研究結(jié)果證實(shí)尿液中所含的結(jié)合雌激素中的確成分復(fù)雜，幾乎包含雌激素代謝過(guò)程中所有的中間產(chǎn)物。

早在上個(gè)世紀(jì)30年代左右，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)懷孕的婦女尿液中存在大量的雌激素成分并作了進(jìn)一步提取，接著Zonedek等人又在孕馬尿中發(fā)現(xiàn)大量的水溶性結(jié)合態(tài)雌激素，引起了很多學(xué)者的關(guān)注并在此后多年致力于分離純化云馬尿中的結(jié)合雌激素的工作，終于在1938年Schacter和Marian首次采用萃取法成功從孕馬尿中分離出了雌酮硫酸鹽[2]。隨后的幾年針對(duì)結(jié)合雌激素的應(yīng)用開(kāi)發(fā)、藥效分析研究一直是學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，終于在1942年FDA首次通過(guò)了美國(guó)惠氏-艾爾斯特制藥公司生產(chǎn)的結(jié)合雌激素藥品倍美力（Premarine）的正式使用，認(rèn)為該藥對(duì)更年期綜合癥及相關(guān)癥狀安全有效。隨著近現(xiàn)代精密的分析鑒定儀器的開(kāi)發(fā)，促進(jìn)了人們對(duì)未知成分的結(jié)構(gòu)分析鑒定手段的進(jìn)步，近代更多的研究則主要集中于結(jié)合雌激素分離方法優(yōu)化，組分及化學(xué)結(jié)構(gòu)分析研究。

1 結(jié)合雌激素分離純化方法研究進(jìn)展

雌激素代謝的所有中間體和最終產(chǎn)物幾乎都是甾體化合物，并且以硫酸鹽的形式存在于孕馬尿中，利用其特殊結(jié)構(gòu)及其物理化學(xué)性質(zhì)，從上個(gè)世紀(jì)30年代開(kāi)始隨著現(xiàn)代化的分離技術(shù)進(jìn)步，學(xué)者們開(kāi)發(fā)了多種結(jié)合雌激素純化的方法，分離效果、回收率也在不斷提高，主要有以下幾種方法。

1.1 萃取法及沉淀法

早期開(kāi)展純化工作，由于實(shí)驗(yàn)器械簡(jiǎn)單，對(duì)結(jié)合雌激素類物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)了解有限，大部分采用的是沉淀法和萃取法。

通過(guò)在原料混合物中加入某些試劑和結(jié)合雌激素發(fā)生反應(yīng)形成沉淀或使其在溶劑中溶解度大幅下降，來(lái)分離獲得有效成分的方法是沉淀法。Russell，Murker等人在1938年采用經(jīng)典的沉淀結(jié)晶法從孕馬尿中分離出了孕二醇、孕二酮等結(jié)合雌激素有效成分。

利用雌激素代謝物在互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同的性質(zhì)開(kāi)發(fā)出了萃取法，這也是早期研究的最多的分離結(jié)合雌激素的方法。Schacter和Marian首次從孕馬尿中分離出了雌酮硫酸鹽就是采用的該方法。由于萃取操作簡(jiǎn)便，成本低廉，一直作為初級(jí)分離的首選方法。幾十年間不乏有專利和文獻(xiàn)報(bào)道了采用該方法進(jìn)行分離。最近的采用該方式純化的是Gerling Klaus-Guenter和Ban Ivan等[3]公布的一個(gè)專利US8815299，仍然采用的是液-液萃取法，采用乙酸酯、乙醚、二氯甲烷、甲基叔丁醚組成的一組溶劑采用液-液萃取法，富集孕驢尿中的結(jié)合雌激素，并且利用了現(xiàn)代化的萃取儀器提高回收率，同時(shí)去除黃酮類非結(jié)合態(tài)甾體類化合物。

早期萃取設(shè)備簡(jiǎn)易，液-液萃取時(shí)，容易造成乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致分離提取效率低、周期長(zhǎng)，并且有機(jī)試劑用量高，嚴(yán)重的污染環(huán)境，并且造成成本難以下降。在柱層析技術(shù)出現(xiàn)后，已經(jīng)較少的用于結(jié)合雌激素的分離。

1.2 柱分離法

幾十年里，人們對(duì)于結(jié)合雌激素主要組分結(jié)構(gòu)了解越來(lái)越多，其特殊的化學(xué)性質(zhì)也被一一解析，柱層析法就是利用結(jié)合雌激素類物質(zhì)特殊的官能團(tuán)，主要選取非極性或中極性大孔吸附樹(shù)脂或離子交換樹(shù)脂做填料，有選擇性的高效分離結(jié)合雌激素混合物。隨著新型高分子材料開(kāi)發(fā)的進(jìn)步，利用其作為填料開(kāi)發(fā)新的純化方法是近幾十年里研究該方面的主要手段，目前已有很多相關(guān)專利公開(kāi)。

1968年H.Leon Bradlow等人利用甾體結(jié)構(gòu)物質(zhì)的疏水性，采用一種苯乙烯-二乙烯聚合物非極性樹(shù)脂，成功的從孕馬尿中分離出了結(jié)合雌激素，然而其吸附能力較低，產(chǎn)物中含有10%的尿液固體。1973年Thompson L等人又采用了一種含有季銨官能團(tuán)的強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂Dowex 1-X2-C1提取出了結(jié)合雌激素。兩千年前后，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)有多個(gè)相關(guān)的發(fā)明專利被公開(kāi)，他們大多數(shù)都是采用的大孔樹(shù)脂柱分離法，例如1998年Ivan Ban等人美國(guó)專利US5814624中使用反相硅膠，通過(guò)相當(dāng)復(fù)雜的前處理獲得了結(jié)合雌激素[4]；2002年臺(tái)灣神隆公司宋瓦拉帕和王靜儀[5]等人在專利CN1381240A公開(kāi)了利用非離子大孔樹(shù)脂從孕馬尿中獲得結(jié)合雌激素的粗提物的方法。2005年Lomans等人的美國(guó)專利US6855704公開(kāi)了一種使用了三種非極性和中性的大孔樹(shù)脂反復(fù)精提分離出孕馬尿中不同的結(jié)合雌激素成分的方法[6]。2008年Rasche Heinz-Helmer和Rupp Olaf等人[7]在美國(guó)專利US7439235中公開(kāi)了一種利用中性丙烯酸樹(shù)脂提取孕馬尿的方法，該方法的優(yōu)勢(shì)是可以從曾經(jīng)保存不當(dāng)?shù)脑旭R尿中提取出高活性、高純度的結(jié)合雌激素。2007年高曉黎，肖建民[8]在中國(guó)專利CN1803150A中通過(guò)改進(jìn)H.Leon Bradlow等人的方法，通過(guò)幾種簡(jiǎn)易的方法處理之后，用含有酯基結(jié)構(gòu)的苯乙烯-二乙烯苯中性大孔吸附樹(shù)脂分離孕馬尿，吸附能力得到了有效的提高，增大了回收率，有效降低了成本，并且在2012年獲得了美國(guó)專利號(hào)US8129363。2013年Lomans John和Leiva-paredes Carmen[9]在美國(guó)專利US8349819中公布了一種可以在孕期哺乳動(dòng)物尿液，特別是孕馬尿中獲取結(jié)合雌激素的方法，該方法利用聚甲基丙烯酸樹(shù)脂、聚苯乙烯樹(shù)脂、以及具有硫酸基團(tuán)的苯乙烯-二乙烯苯樹(shù)脂三種不同的樹(shù)脂分別提取結(jié)合雌激素中各種結(jié)構(gòu)的主要成分。

然而柱層析法分離結(jié)合雌激素也存在一定的缺陷，大孔樹(shù)脂機(jī)械強(qiáng)度低，容易破碎，回收次數(shù)少，容易增加成本，另外藥品生產(chǎn)對(duì)于樹(shù)脂材料的選擇比較嚴(yán)格，必須耐強(qiáng)酸堿，且安全無(wú)害，不能引入有害物質(zhì)。馬尿提取結(jié)合雌激素工藝開(kāi)發(fā)仍面臨許多挑戰(zhàn)，需要隨著新的技術(shù)和材料的開(kāi)發(fā)不斷調(diào)整。

2 結(jié)合雌激素組分的定性定量方法研究進(jìn)展

結(jié)合雌激素成分復(fù)雜，在理論上，孕馬尿中的結(jié)合激素應(yīng)包含雌激素代謝過(guò)程中幾乎所有的中間體，早期的研究發(fā)現(xiàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)其至少含有200中以上的成分，其中很多結(jié)構(gòu)至今還不明確。早期的分析工作只能分離并分析出毫克級(jí)以上的組分，隨著儀器分析的發(fā)展，目前主要利用氣相-質(zhì)譜、液相、薄層層析、放射免疫分析、光密度分析等[10]。

2.1 氣相色譜法

氣相色譜的發(fā)明使得許多易揮發(fā)易氧化的物質(zhì)分離檢測(cè)成為可能，結(jié)合雌激素是芳香族有機(jī)化合物，常溫下見(jiàn)光或暴露在空氣中都易使結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在惰性氣體環(huán)境下分離并檢測(cè)無(wú)疑可以得到較準(zhǔn)確的定性及定量結(jié)果。

Lyman Garw等人[11]在1982年就利用熔融硅膠毛細(xì)管氣相色譜法檢測(cè)出倍美力（Premarine）中的10種雌激素類成分。2001年，汪潔，胡建國(guó)等人[12]，將水解后的游離雌激素硅烷化處理后，用RtxR-255氣相色譜柱檢測(cè)出倍美力軟膏中6種結(jié)合雌激素，其中雌酮、馬烯雌酮、17α-馬烯雌酮定量回收率均達(dá)到100%，RSD低于1.5%。

2.2 液相和液-質(zhì)法

結(jié)合雌激素多從孕馬尿中經(jīng)柱層析方法提取，液相對(duì)溶劑的要求、檢測(cè)條件的控制沒(méi)有氣-質(zhì)嚴(yán)格，且不需要像氣相檢測(cè)一樣需要做柱前衍生，更易于操作，同時(shí)芳香族化合物在紫外下有特征吸收，采用常規(guī)紫外檢測(cè)器即可達(dá)到分離檢測(cè)的目的，因此近些年來(lái)的定性定量工作多采用液相、液相串聯(lián)一級(jí)質(zhì)譜、液相串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜。

Gatti R[13]用HPLC-熒光測(cè)定孕馬尿中馬烯雌酮和馬萘雌酮，采用ODS色譜柱，三乙胺磷酸鹽為緩沖液，分離氯仿萃取后的孕馬尿，在λex=280nm,λem=410nm和320 nm熒光檢測(cè)到分離效果較好的馬烯雌酮和馬萘雌酮。John C.Reepmeyer等人[14]在2005年通過(guò)液相-電噴霧質(zhì)譜法成功分離了結(jié)合雌激素中馬烯雌酮和他的同分異構(gòu)體Δ8,9-脫氫雌酮硫酸鈉鹽。Jerry Tso等人[15]在2010年利用液-質(zhì)/質(zhì)方法成功分離并定量了牛奶中的雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇以及他們的結(jié)構(gòu)類似的代謝物硫酸鹽，并且對(duì)于游離雌激素優(yōu)化回收率到72%-117%，結(jié)合雌激素回收率達(dá)62%～112%。

2.3 其他方法

Morgan MRA等人在1980年發(fā)現(xiàn)了一種直接的、高精度的放射免疫分析發(fā)測(cè)定馬烯雌酮的方法，該方法靈敏度高達(dá)50 pg/ml。然而該方法容易發(fā)生合成雌激素免疫原交叉反應(yīng)，且對(duì)于檢測(cè)設(shè)備條件要求較高，現(xiàn)在已很少使用。

Novakovic J等人[16]用光密度分析檢測(cè)結(jié)合雌激素原料藥及其制劑，酶水解出游離的雌酮、馬烯雌酮等游離雌激素，用氯仿萃取之后，在薄層板上分離并在280nm下直接掃描定量分析。該方法簡(jiǎn)單、迅速且重復(fù)性較好。同時(shí)他們又采用熒光光密度分析法同樣得到了很好的檢測(cè)結(jié)果，基本與美國(guó)藥典（USP21版）所述方法的檢測(cè)結(jié)果一致。姚軍高曉黎[17]等人在2011年也成功采用銀化硅膠薄層層析法快速定性了新疆孕馬尿中的雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉及17α-二氫馬烯雌酮硫酸鈉。

FDA早在1942年就批準(zhǔn)了結(jié)合雌激素藥品倍美力（Premarine）的正式使用，并在美國(guó)藥典中主要嚴(yán)格控制雌酮硫酸鈉，馬烯雌酮硫酸鈉，17α-17β-雌二醇硫酸鈉，17α-二氫馬烯雌酮硫酸鈉，等10中結(jié)合雌激素成分。經(jīng)過(guò)多年的研究，目前可以確定孕馬尿提取出的結(jié)合雌激素中至少含有200種成分，每升約含量結(jié)合雌激素70-130mg，并隨妊娠期階段不同尿液各組分含量有一定差異。

3 發(fā)展與展望

目前馬尿提純結(jié)合雌激素工藝已日趨完善，隨著分離技術(shù)的進(jìn)步，其純化工藝將向安全、有效、經(jīng)濟(jì)、有利于產(chǎn)業(yè)化的方向發(fā)展；結(jié)合雌激素中主要成分的結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，然而馬屬動(dòng)物妊娠期不同時(shí)間段和不同種類、不同地域的馬屬動(dòng)物其尿液中結(jié)合雌激素含量均不同，對(duì)其規(guī)律的探索有助于結(jié)合雌激素產(chǎn)業(yè)化研究和馬屬動(dòng)物遺傳學(xué)方面研究的開(kāi)展；結(jié)合雌激素作為激素替代療法被應(yīng)用于多種更年期綜合病癥的治療，然而其成分復(fù)雜，有效成分都是雌激素的代謝產(chǎn)物或中間產(chǎn)物，其藥效是多種有效成分共同作用產(chǎn)生的，明確其有效成分在體內(nèi)的調(diào)控機(jī)理對(duì)使用其治療更多其他病癥具有巨大意義。

馬屬動(dòng)物的消化器官構(gòu)造與代謝機(jī)能相似，理論上馬屬動(dòng)物尿液均能分離出結(jié)合雌激素。我國(guó)驢種資源豐富，肉驢是傳統(tǒng)畜牧業(yè)的一個(gè)重要組成部分，目前驢的飼養(yǎng)主要用于產(chǎn)皮、產(chǎn)肉、產(chǎn)奶，然而其尿液的利用研究卻幾乎是空白。驢對(duì)蛋白質(zhì)的吸收略低于反芻動(dòng)物，而高于馬、騾子，其尿液中雌激素含量必定與其他馬屬動(dòng)物有著較大差異，對(duì)其尿液中結(jié)合雌激素含量的研究必定對(duì)馬屬動(dòng)物遺傳學(xué)探索具有很大意義，且具有一定的產(chǎn)業(yè)化前景。

[1]張?zhí)m蘭，趙文軍，吳雪萍．孕馬尿中甾體成分及其活性的研究現(xiàn)狀[J]．天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2003，15 (4)：354-358.

[2]木拉塔力·克力木，高曉黎．天然雌激素來(lái)源—孕馬尿研究進(jìn)展[J]．西北藥學(xué)雜志，2009，24(1)：76-78.

[3]Ban Ivan，Gerling KG，Mueller HJ，et al．Method for obtaining a natural mixture of conjugated equine estrogens depleted in non-conjugated lipophilic compounds[P]．US Pat：8815299B2，2014-8-26.

[4]孔金金，高曉黎．從孕馬尿中提取分離結(jié)合雌激素的方法研究進(jìn)展[J]．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2007，2(33)：184-185.

[5]Soon VL，Wang JY．Process for the preparation of conjugated estrogens from pregnant mare urine[P]．CN Pat：1381240A，2002-11-27.

[6]Lomans John，Leiva-paredes Carmen．Process for isolating conjugated estrogens[P].US Pat：6855704，2005-02-15.

[7]Rasche，Heinz-Helmer，Rupp Olaf．Method for obtaining estrogens from mare’s urine[P].US Pat：7439235B2，2008-10-21.

[8]高曉黎，肖建民．從孕馬尿中獲取結(jié)合雌激素混合物方法極其所用大孔吸附樹(shù)脂的應(yīng)用[P].CN Pat：1803150A，2006-7-19.

[9]Lomans John，Leiva-paredes Carmen．Steroid extraction process from urine sources[P]．US Pat：8349819，2013-1-8.

[10]郭玉，高曉黎．結(jié)合雌激素分析方法研究進(jìn)展[J]．藥物分析雜志，2004，24(5)：568-571.

[11]Lyman Gary W，Johnson Raymond N．Assay for conjugated estrogens in tablets using fused silica capillary gas chromatography[J]．Journal of Chromatography A，1982，234(1)：234-239

[12]汪潔，胡建國(guó)，李建華．硅烷化氣相色譜法測(cè)定注射用倍美力和倍美力軟膏中結(jié)合態(tài)雌激素[J]．藥物分析雜志，2001，21(1)：18-21.

[13]Gatti R，Gotti R，Gioia MG，et al．HPLC analysis of pharmaceutical estrogens in a raw materials and dosage form[J]．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1998，17(2)：337-347.

[14]Reepmeyer JC，Brower JF,Ye H.Separation and detection of the isomeric equine conjugated estrogens, equilin sulfate and Δ8,9-dehydroestrone sulfate,by liquid chromatography–electrospray-mass spectrometry using carbon-coated zirconia and porous graphitic carbon stationary phases[J].Journal of Chromatography A，2005，1083(1-2)：42-51.

[15]Tso Jerry，Aga D S.A systematic investigation to optimize simultaneous extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis of estrogens and their conjugated metabolites in milk[J]. Journal of Chromatography A，2010，1217(29)：4784-4795.

[16]Novakovic J，Agbaba D，Vladimirov S，et al.Densitometric Determination of conjugated estrogens in the raw material and in pharmaceutical preparations[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis，1990，8(3)：253.

[17]姚軍，高曉黎，等.新疆孕馬尿中主要結(jié)合雌激素定性定量方法研究[J].藥物分析雜志，2011，31(8): 1471-1474.

Research Advance of Conjugated Estrogens Purification and Component Analysis

ZUO Xiao-jia1，ZHENG Wen-xin1，TUOHUTI·Aji-de2，MAO Qiong-ling1,Xiao Hai-xia2
（1.Livestock Husbandry Standardization Institute of Animal Science Academy, 2.Animal Science Institute of Animal Science Academy,Urumqi 830000,China）

Estrogen metabolites extracted from pregnant mare urine called conjugated estrogens,which has been used to treat menopause symptoms caused by estrogen deficiency.Many research results of conjugated estrogens have been obtained in the last century.In this article,the methods of separation and purification were summarized,and the structural analysis advances were was reviewed,and further in-depth study was prospected.

Conjugated estrogens;pregnantmare urine;separation and purification;Component identification

S821

：A

：1003－6377（2015）05－0001-05

農(nóng)業(yè)部財(cái)政項(xiàng)目“中國(guó)馬驢品種資源評(píng)價(jià)”（農(nóng)財(cái)2009）

張莉（1975-），女，副研究員，博士 ，主要從事肉羊遺傳育種 、資源保護(hù)和行業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài)等研究。E-mial：zhangli@263.net

杜立新（1956-），男，教授，主要從事肉羊分子遺傳育種、畜禽遺傳資源保護(hù) 、養(yǎng)羊生產(chǎn)等方面的研究 。

2015-06-20，

2015-07-08