內(nèi)臟高敏感大鼠結(jié)腸特異背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元TRPV1表達(dá)和電生理特征變化*

袁莉莉1#余躍1&蔣楠1陳鳳琴1王巧民1王烈成2

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院消化內(nèi)科1(230001)安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室2

*基金項目：安徽省自然科學(xué)基金項目(1208085MH174)；2010年安徽省高校省級自然科學(xué)研究重點項目(KJ2010A192)

#Email: yuan30303@163.com

背景：內(nèi)臟高敏感被認(rèn)為是腸易激綜合征的主要病理生理機(jī)制之一。目的：探討內(nèi)臟高敏感大鼠結(jié)腸特異背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元上的TRPV1表達(dá)及其電生理特征。方法：20只10 d齡大鼠隨機(jī)分為模型組和對照組，模型組以結(jié)直腸內(nèi)灌注乙酸誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏感模型，對照組灌注等量0.9% NaCl溶液。以結(jié)腸壁注射DiI熒光染料逆行標(biāo)記DRG神經(jīng)元(即結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元)，免疫熒光法檢測DRG神經(jīng)元上的TRPV1表達(dá)，膜片鉗技術(shù)記錄神經(jīng)元電生理特征。結(jié)果：模型組結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元上的TRPV1表達(dá)陽性率明顯高于對照組(46.1%對36.6%,P<0.01)，平均閾電流值明顯低于對照組[(57.80±1.32) pA對(73.45±4.51) pA,P<0.05]，2倍閾電流刺激下動作電位頻率明顯高于對照組[(8.20±1.10) Hz對(4.54±0.66) Hz,P<0.05]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組60 mm Hg 結(jié)直腸擴(kuò)張壓力下的腹壁回撤反射(AWR)評分與TRPV1表達(dá)陽性率、2倍閾電流刺激下動作電位頻率呈正相關(guān)(r=0.87和r=0.73,P<0.01)，與閾電流值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.81,P<0.01)。結(jié)論：結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元TRPV1表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞興奮性增加，可能是內(nèi)臟高敏感形成的重要環(huán)節(jié)。

關(guān)鍵詞內(nèi)臟高敏感；背根神經(jīng)節(jié)；瞬時受體電位通道；TRPV1；膜片鉗術(shù)；電生理學(xué)

Patch-Clamp Techniques;Electrophysiology

內(nèi)臟高敏感被認(rèn)為是腸易激綜合征的主要病理生理機(jī)制之一[1]。脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)作為痛覺傳入的第一級神經(jīng)元，在痛覺的外周機(jī)制中起重要作用[2]。研究[3]顯示瞬時受體電位香草素受體1(transient receptor potential vanilloid type-1, TRPV1)參與了內(nèi)臟高敏感的觸發(fā)和維持，然而結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元上的TRPV1表達(dá)及其電生理特征鮮見報道。本研究應(yīng)用內(nèi)臟高敏感大鼠模型并與正常對照組進(jìn)行對比，以明確結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元TRPV1表達(dá)和細(xì)胞興奮性在內(nèi)臟高敏感形成中的作用。

材料與方法

一、實驗動物

5 d齡SPF級Sprague-Dawley大鼠20只，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。每10只幼鼠與1只哺乳母鼠共同飼養(yǎng)于1個塑料籠內(nèi)，母鼠自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為每12 h晝夜節(jié)律變換，室溫18~24 ℃，幼鼠與母鼠分離后每4只1籠喂養(yǎng)。

二、方法

1. 模型制備和內(nèi)臟敏感性評估[4]：幼鼠自10 d起隨機(jī)分為2組，每組10只：①內(nèi)臟高敏感模型組：10~23 d內(nèi)，每天予結(jié)直腸內(nèi)灌注乙酸。將經(jīng)石蠟油潤滑的連續(xù)硬膜外導(dǎo)管(直徑1 mm)經(jīng)肛門插入2 cm，注入0.5% 乙酸0.2 mL。②對照組：每天結(jié)直腸內(nèi)灌注等量0.9% NaCl溶液。23 d后的2周內(nèi)，不進(jìn)行任何實驗操作。灌注結(jié)束2周后，將壓力表、注射器與自制指套氣囊以三通管連接，將氣囊經(jīng)肛門插入2 cm。大鼠置于透明塑料籠內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境30 min后行結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal distention, CRD)，氣囊注氣壓力分別為20、40、60、80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，每次持續(xù)20 s后休息2 min。通過觀察腹壁回撤反射(abdominal withdrawal reflex, AWR)判定內(nèi)臟敏感性。AWR評分標(biāo)準(zhǔn)：有動作停頓并見短暫頭部運動，1分；腹肌收縮，2分；腹部抬起，3分；身體呈弓狀和骨盆抬起，4分。AWR的觀察采用雙盲法，操作者隨機(jī)時相性向氣囊內(nèi)注氣，觀察者同步獨立觀察、評估AWR并記錄評分。每一壓力重復(fù)擴(kuò)張3次，AWR評分取均值。

2. 逆行標(biāo)記結(jié)腸特異DRG和TRPV1免疫熒光法檢測[5]：大鼠8周齡時麻醉，開腹暴露結(jié)腸，于結(jié)腸膀胱水平向口腔方向約6 cm處取10~15個點，每點注射1 μL熒光染料1,1’-二(十八烷基)-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽(DiI，InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific Inc.)。為防止染料泄漏、污染相鄰器官，注射針留針1 min，且每點注射后均以0.9% NaCl溶液清洗。DiI注射1周后，迅速分離L5~S1DRG，置于4%多聚甲醛溶液中固定6~8 h，移至4 ℃ 30%蔗糖溶液中沉淀。恒冷切片機(jī)切片，切片以10%兔血清封閉1 h，加入羊抗大鼠TRPV1多克隆抗體(1∶100稀釋, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)4 ℃過夜，加入FITC標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶50稀釋, 武漢博士德生物工程有限公司)37 ℃避光孵育30 min，Hoechst(碧云天生物技術(shù)研究所)染核，甘油封片。每個DRG隨機(jī)取3張切片，每張切片隨機(jī)取3個視野，計算TRPV1陽性細(xì)胞占總DiI標(biāo)記細(xì)胞的百分率。

3. 全細(xì)胞膜片鉗記錄[6]：DiI注射1周后，迅速分離T13~L2、L5~S1DRG，置于含胰蛋白酶和膠原酶的DMEM培養(yǎng)基中消化后制成細(xì)胞懸液，滴加于小玻片上，行全細(xì)胞膜片鉗記錄。記錄時濾波頻率為1 kHz，采集頻率為10 kHz。在電流鉗模式下，分別檢測模型組和對照組各20個DRG神經(jīng)元，以引起細(xì)胞產(chǎn)生動作電位的最小刺激電流為閾電流，記錄閾電流值和2倍閾電流刺激下的動作電位頻率，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

一、 AWR評分

20 mm Hg CRD壓力下，模型組與對照組間AWR評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；40、60、80 mm Hg CRD壓力下，模型組AWR評分均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)，提示內(nèi)臟高敏感模型建立成功。

*兩組間比較，P<0.05

二、結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元TRPV1表達(dá)

TRPV1免疫陽性神經(jīng)元多為中小型細(xì)胞，DiI標(biāo)記的結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元上可見TRPV1表達(dá)(圖2)，未見大細(xì)胞表達(dá)TRPV1。模型組DiI標(biāo)記的323個結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元上，TRPV1陽性細(xì)胞數(shù)為149個，對照組DiI標(biāo)記的322個結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元上，TRPV1陽性細(xì)胞數(shù)為118個，兩組間TRPV1表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(46.1%對36.6%,P<0.01)。

三、結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元閾電流值和動作電位頻率變化

在電流鉗模式下，模型組結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元平均閾電流值為(57.80±1.32) pA，對照組為(73.45±

4.51) pA，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在500 ms的記錄時間內(nèi)，模型組2倍閾電流刺激下動作電位頻率為(8.20±1.10) Hz，對照組為(4.54±0.66) Hz，組間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

四、內(nèi)臟敏感性與結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元TRPV1表達(dá)和電生理特征的相關(guān)性

Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示，在60 mm Hg的CRD壓力下，模型組AWR評分與結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元TRPV1表達(dá)陽性率(r=0.87,P<0.01)和2倍閾電流刺激下動作電位頻率(r=0.73,P<0.01)呈正相關(guān)，與閾電流值(r=-0.81,P<0.01)呈負(fù)相關(guān)，提示隨著AWR評分的增加，結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元TRPV1表達(dá)和細(xì)胞興奮性增加。

討論

腸道感覺神經(jīng)傳導(dǎo)通路包含三級神經(jīng)元：DRG神經(jīng)元、脊髓背角神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元，各種類型的神經(jīng)纖維將三級神經(jīng)元聯(lián)系在一起，形成感覺通路，傳入通路中任意環(huán)節(jié)的異常變化都會導(dǎo)致機(jī)體感覺異常。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，幼年期結(jié)直腸內(nèi)灌注0.9% NaCl溶液的大鼠與幼年期未予A：DiI標(biāo)記的結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元；B：TRPV1免疫陽性神經(jīng)元；C：Hoechst染色細(xì)胞核；D：A、B、C合成圖，向下箭頭所示為DiI、TRPV1、Hoechst共表達(dá)細(xì)胞，向右箭頭所示為DiI、Hoechst共表達(dá)細(xì)胞，無TRPV1表達(dá)

圖2結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元TRPV1表達(dá)(免疫熒光染色)

A：對照組閾電流刺激下動作電位頻率；B：對照組2倍閾電流刺激下動作電位頻率；C：模型組閾電流刺激下動作電位頻率；D：模型組2倍閾電流刺激下動作電位頻率

圖3結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元動作電位頻率變化

灌腸的大鼠對CRD刺激的AWR評分無明顯差異，故本研究采用目前國內(nèi)外較為公認(rèn)的慢性內(nèi)臟致敏模型[7]，僅選用幼年期0.9% NaCl溶液灌腸大鼠作為對照，探討乙酸刺激結(jié)直腸內(nèi)臟高敏感形成后結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元的TRPV1表達(dá)和電生理特征變化情況。此外，由于支配結(jié)腸的DRG多集中于T13~L2、L5~S1區(qū)域內(nèi)[8]，其他區(qū)域結(jié)腸特異DRG分布相對較少，故本研究選擇這兩個區(qū)域的DRG為研究對象，未能取其他區(qū)域的DRG作為對照是本研究的不足之處。

本研究通過在實驗大鼠結(jié)腸壁注射DiI熒光染料逆行示蹤觀察到，在DiI標(biāo)記的結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元上，內(nèi)臟高敏感模型組TRPV1表達(dá)陽性率顯著增加，且與內(nèi)臟敏感性呈正相關(guān)，故推測其致敏機(jī)制可能與結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元上部分TRPV1的敏化有關(guān)。有研究顯示，在三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型中，局部炎癥能增加腸神經(jīng)支配的DRG上的TRPV1表達(dá)[9]；在避水應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感大鼠模型中亦發(fā)現(xiàn)，DRG神經(jīng)元上的TRPV1表達(dá)增加，且使用TRPV1拮抗劑能明顯減弱內(nèi)臟敏感性、阻礙TRPV1表達(dá)上調(diào)[10]。這些研究均提示DRG神經(jīng)元上的TRPV1表達(dá)增加在內(nèi)臟高敏感的形成中具有重要作用，與本研究結(jié)果相符。

TRPV1主要分布于DRG和三叉神經(jīng)節(jié)中的中、小直徑神經(jīng)元，是初級感覺神經(jīng)元外周末梢傷害性刺激的分子整合者，可被辣椒素、H+和傷害性熱刺激(>43 ℃)激活，同時神經(jīng)肽、緩激肽、前列腺素、神經(jīng)生長因子、5-羥色胺等可通過TRPV1途徑直接刺激神經(jīng)的疼痛感受器[11]。TRPV1激活后導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，神經(jīng)元細(xì)胞膜去極化，產(chǎn)生動作電位，并將這些信息上傳至中樞，最終形成痛覺過敏[10]。研究[12]發(fā)現(xiàn)TRPV1是神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)進(jìn)程中的重要介質(zhì)，感覺神經(jīng)元上的TRPV1接受刺激后引起細(xì)胞膜去極化，直接或間接激發(fā)傳入神經(jīng)末梢釋放P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)等感覺神經(jīng)肽。同時，TRPV1還可與多種信號分子相互作用，如蛋白酶激活受體，參與內(nèi)臟高敏感形成[13]。

本研究應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗電流鉗技術(shù)記錄到內(nèi)臟高敏感模型組結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元平均閾電流值顯著低于對照組，在500 ms的記錄時間內(nèi)，模型組2倍閾電流刺激下動作電位頻率顯著高于對照組，提示模型組結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元的興奮性高于對照組。上述結(jié)果表明內(nèi)臟高敏感伴有結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元興奮性增加，表現(xiàn)為閾電流降低和動作電位頻率增加。推測乙酸刺激結(jié)直腸引起的局部炎癥能增加腸神經(jīng)支配的DRG上的TRPV1表達(dá)，激活的TRPV1引起Ca2+內(nèi)流，神經(jīng)元細(xì)胞膜去極化，產(chǎn)生動作電位，參與痛覺過敏形成。本研究通過相關(guān)性分析證實內(nèi)臟高敏感與結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元的TRPV1表達(dá)和細(xì)胞興奮性增加之間存在密切聯(lián)系。

既往研究顯示多種內(nèi)臟炎癥后可見DRG神經(jīng)元興奮性增加，如胃潰瘍[14]、慢性胰腺炎[15]、間質(zhì)性膀胱炎[16]等，可能與神經(jīng)元上的重要離子(如Na+、K+、Ca2+)通道、嘌呤能受體功能改變有關(guān)[2]。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟高敏感大鼠模型結(jié)腸特異DRG神經(jīng)元TRPV1表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞興奮性增加，可能是內(nèi)臟高敏感形成的重要環(huán)節(jié)，為后續(xù)擬開展的脊髓電刺激治療腸易激綜合征內(nèi)臟高敏感性腹痛的研究奠定了基礎(chǔ)。

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(2014-11-27收稿；2015-01-25修回)

·共識與指南·

Expression of TRPV1 and Electrophysiological Characteristics of Colon-specific Dorsal Root Ganglion Neurons in Rat Model of Visceral HypersensitivityYUANLili1,YUYue1,JIANGNan1,CHENFengqin1,WANGQiaomin1,WANGLiecheng2.1DepartmentofGastroenterology,AffiliatedProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei(230001);2DepartmentofPhysiology,AnhuiMedicalUniversityBasicMedicalCollege,Hefei

Correspondence to: YU Yue, Email: yuyuemd@163.com

Background: Visceral hypersensitivity is considered to be one of the major pathophysiological mechanisms of irritable bowel syndrome. Aims: To investigate the expression of TRPV1 and electrophysiological characteristics of colon-specific dorsal root ganglion (DRG) neurons in rat model of visceral hypersensitivity. Methods: Twenty 10-day-old rats were randomly divided into two groups. In model group, visceral hypersensitivity was induced by colorectal administration of acetic acid; while in control group the same amount of saline was administered. Colon-specific DRG neurons were labeled retrogradely by injection of DiI, a fluorochrome, into the colon wall. Expression of TRPV1 in DRG neurons was detected by immunofluorescence and the electrophysiological characteristics of DRG neurons was detected by using patch-clamp technique. Results: In model group, the expression rate of TRPV1 in colon-specific DRG neurons was significantly higher than that in controls (46.1%vs. 36.6%,P<0.01), the average rheobase was significantly decreased [(57.80±1.32) pAvs. (73.45±4.51) pA,P<0.05], while the frequency of action potentials (APs) in response to doubling rheobase stimulation was significantly increased [(8.20±1.10) Hzvs. (4.54±0.66) Hz,P<0.05]. Score of abdominal withdrawal reflex (AWR) under a 60 mm Hg colorectal distention was positively correlated with the expression rate of TRPV1 and the frequency of APs in response to doubling rheobase stimulation (r=0.87 andr=0.73,P<0.01), but was negatively correlated with the rheobase (r=-0.81,P<0.01) in model group. Conclusions: Increased expression of TRPV1 and excitability in colon-specific DRG neurons might be a crucial step in formation of visceral hypersensitivity.

Key wordsVisceral Hypersensitivity;Dorsal Root Ganglion;Transient Receptor Potential Channels;TRPV1;

通信作者&本文，Email: yuyuemd@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.06.005