胡永靈，葉世莉，羅佳捷

（1．湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南衡陽421005；2．衡陽市富礦飼料添加劑公司，湖南衡陽421004；3．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

中草藥制劑對(duì)熱應(yīng)激奶牛泌乳性能、抗氧化能力及免疫功能的影響

胡永靈1*，葉世莉2，羅佳捷3

（1．湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南衡陽421005；2．衡陽市富礦飼料添加劑公司，湖南衡陽421004；3．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

為探討復(fù)合中草藥制劑對(duì)熱應(yīng)激奶牛泌乳性能、抗氧化能力及免疫功能的影響，選擇產(chǎn)奶中后期的健康中國(guó)荷斯坦奶牛20頭，按泌乳時(shí)間和產(chǎn)奶量相近的原則均分為A、B、C和D 4組。A組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；B、C和D組分別在每頭牛的基礎(chǔ)日糧中添加50，100和150 g／d水平的復(fù)合中草藥制劑。每天測(cè)定產(chǎn)奶量，在試驗(yàn)的第1（添加復(fù)合中草藥制劑之前）、20和40天逐頭采集血樣，測(cè)定不同劑量復(fù)合中草藥制劑對(duì)熱應(yīng)激奶牛血淋巴細(xì)胞凋亡率、血液抗氧化酶GSH-Px、CAT基因及血淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、p53表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，B、C和D組的日產(chǎn)奶量較對(duì)照組分別提高了20．26%（P＜0．05），24．20%（P＜0．05）和16．98%（P＞0．05）；乳中體細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組分別降低了21．68%（P＜0．05），29．88%（P＜0．05）和24．22%（P＜0．05）；奶牛血液抗氧化酶GSH-Px、CAT基因的表達(dá)水平分別比對(duì)照組提高了5．00%（P＞0．05），13．00%（P＜0．05），6．00%（P＞0．05）和5．00%（P＞0．05），16．00%（P＜0．05），3．00%（P＞0．05）；奶牛血淋巴細(xì)胞平均凋亡率分別比A組降低了18．20%（P＞0．05），17．86%（P＞0．05）和12．51%（P＞0．05）；奶牛血淋巴細(xì)胞Bcl-2在20，40 d時(shí)均極顯著高于A組，全期的平均水平分別比對(duì)照組高出105．00%（P＞0．05），113．00%（P＞0．05）和57．00%（P＞0．05）；p53基因的表達(dá)水平在20，40 d時(shí)均極顯著低于A組，全期的平均水平分別比對(duì)照組降低了24．00%（P＞0．05），28．00%（P＞0．05）和20．00%（P＞0．05）。試驗(yàn)組中，C組奶牛的日產(chǎn)奶量、體細(xì)胞數(shù)、血液抗氧化酶活性、淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)等指標(biāo)要優(yōu)于B、D組；而血液淋巴細(xì)胞凋亡率指標(biāo)為B組最好。說明復(fù)合中草藥制劑能有效改善熱應(yīng)激奶牛的泌乳性能、抗氧化能力及免疫功能，且在本試驗(yàn)條件下，每頭牛日糧中添加100 g／d水平的效果要優(yōu)于50及150 g／d水平。

奶牛；中草藥；泌乳性能；抗氧化能力；免疫功能

奶牛養(yǎng)殖是我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)中的一個(gè)重要組成板塊，飼料營(yíng)養(yǎng)與配制、生產(chǎn)環(huán)境是健康優(yōu)質(zhì)奶源的重要保障。近年來我國(guó)學(xué)者們?cè)谕ㄟ^調(diào)整飼料組合、調(diào)制方法等來提高奶牛的生產(chǎn)性能等方面進(jìn)行了大量的研究，也取得了豐碩的成果［1-3］。生產(chǎn)環(huán)境的變化特別是我國(guó)夏季炎熱高溫是一個(gè)普遍現(xiàn)象，當(dāng)牛舍的溫濕指數(shù)（THI）大于72時(shí)，奶牛便處于熱應(yīng)激狀態(tài)［4］，而熱應(yīng)激對(duì)奶牛的生產(chǎn)性能、繁殖性能及免疫性能等方面均有非常不利的影響［5-7］，因此，探索減少或緩解熱應(yīng)激的途徑一直是奶牛飼養(yǎng)業(yè)特別是南方奶牛飼養(yǎng)業(yè)的重大課題之一。天然中草藥是我國(guó)民間傳統(tǒng)瑰寶，其中一部分具有消炎、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、改善機(jī)體免疫狀態(tài)、促進(jìn)生長(zhǎng)和提高飼料轉(zhuǎn)化率等多種功效，由于它無抗藥性和耐藥性，無藥物殘留和不良反應(yīng)少，在畜禽養(yǎng)殖方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［8］。近年來，有關(guān)學(xué)者對(duì)中草藥制劑在奶?？篃釕?yīng)激［9-12］、改善奶?？寡趸阅埽?3-14］及免疫性能［15-16］等方面的作用效果進(jìn)行了初步研究，但欠深入。有研究指出，人體抑癌基因（p 53）能通過促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞凋亡來削弱機(jī)體抗應(yīng)激的能力［17］，而抗細(xì)胞凋亡的B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）能有效提高機(jī)體對(duì)抗熱應(yīng)激的能力［18］；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）與超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）均是生物機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，在清除自由基、H2O2和過氧化物以及減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮著十分重要的作用［19-20］，而中草藥制劑對(duì)奶牛體內(nèi)抗氧化酶、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡率的影響尚未見報(bào)道。本研究擬探索復(fù)合中草藥制劑對(duì)奶牛體內(nèi)GSH-Px、CAT、Bcl-2、p53基因表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡率的影響，為揭示中草藥制劑調(diào)控奶牛抗熱應(yīng)激機(jī)理的理論研究及其在奶業(yè)安全生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)在湖南省畜牧獸醫(yī)研究所奶牛原種場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期為2013年6月7日至7月16日，其中，前7 d為預(yù)飼期。

1．2 中草藥添加劑的制備

由衡陽市某飼料添加劑有限公司研制生產(chǎn)并提供。根據(jù)中醫(yī)藥理論，選用具有清熱解暑、涼血解毒、益氣養(yǎng)陰、加強(qiáng)免疫機(jī)能的中藥材進(jìn)行組方，包括王不留行、山藥、何首烏、益母草、山楂、澤瀉、菟絲子、蛇床子、漏蘆、白芍、烏藥和黃芪等，以我國(guó)中醫(yī)藥傳統(tǒng)的炮制方法為基礎(chǔ)，采用發(fā)酵工藝與現(xiàn)代微納米技術(shù)及工藝，將其制成3～5μm直徑顆粒的復(fù)合中草藥制劑。

1．3 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇、分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)奶牛的產(chǎn)奶量和泌乳時(shí)間相近的原則選取20頭健康的泌乳中后期中國(guó)荷斯坦奶牛，隨機(jī)均分成A、B、C和D 4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭牛。A組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；B、C和D組分別在每頭牛的基礎(chǔ)日糧中添加50、100和150 g／d水平的中草藥制劑，預(yù)飼7 d，正式試驗(yàn)期33 d。分組及處理見表1。

1．4 試驗(yàn)日糧及飼養(yǎng)管理

奶牛基礎(chǔ)日糧及飼喂量主要為青貯玉米秸稈15 g／d、矮象草10 kg／d、啤酒糟8 kg／d及配合精料4 kg／d，精料參照《奶牛營(yíng)養(yǎng)需要》（第7版）［21］配制，配方及營(yíng)養(yǎng)成分見表2。試驗(yàn)?zāi)膛＜性谝粭潤(rùn)谏犸曫B(yǎng)，統(tǒng)一管理。試驗(yàn)期間每天分別在5：30和15：00喂料，6：00和17：30擠奶，自由飲水，夜間運(yùn)動(dòng)場(chǎng)放牧。中草藥添加劑在喂料時(shí)添加至精料中，攪拌均勻；預(yù)試期前3 d添加量為正式期的1／3，后4 d為2／3。

1．5 環(huán)境溫濕度及產(chǎn)奶性能測(cè)定

在牛舍內(nèi)兩側(cè)牛床上方距地面1．5 m高處懸掛溫濕度計(jì)，試驗(yàn)期間每天于5：30和14：00記錄溫度和相對(duì)濕度，并計(jì)算溫濕指數(shù)。采用全封閉魚骨式擠奶廳系統(tǒng)流量計(jì)記錄每頭牛每天的產(chǎn)奶量；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，按6∶4比例收集早、晚兩次奶樣，混合后用于測(cè)定乳脂率、乳蛋白率、體細(xì)胞數(shù)，在上海奶牛生產(chǎn)測(cè)定中心實(shí)驗(yàn)室用全自動(dòng)乳成分儀（丹麥，F(xiàn)OSS）測(cè)定。

1．6 采樣

在試驗(yàn)期的第1，20和40天分別從供試奶牛的頸靜脈采血。每頭牛每次采血約為40 m L，分裝成4管（每管10 m L），用肝素鈉抗凝全血，其中2管馬上用牛淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶公司）分離淋巴細(xì)胞，用凍存液懸浮后放入液氮保存。

1．7 基因表達(dá)分析

1．7．1 引物設(shè)計(jì)及合成 基因表達(dá)分析采用熒光定量RT－PCR法，根據(jù)網(wǎng)上（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）發(fā)表的基因序列，以Beta-actin m RNA作內(nèi)參，根據(jù)GenBank中奶牛的GSH-Px、CAT、Bcl-2、p 53和Beta-actin的基因登陸序列（依次為NM001035386、NM174077、BTU92434、BC102440．1和BC142413），用Primer Premier 5．0軟件設(shè)計(jì)引物（表3）。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1．7．2 血液總RNA及淋巴細(xì)胞RNA的提取 血液淋巴細(xì)胞用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行提取；總RNA的提取采用日本基因株式會(huì)社的ISOGEN-LS總RNA抽提試劑盒，并按其說明書操作。所有過程均在無菌操作臺(tái)上進(jìn)行。

1．7．3 反轉(zhuǎn)錄cDNA 采用Revert Aid TM First Strand cDNA Systhesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按試劑盒說明書操作。

1．7．4 cDNA的RT－PCR反應(yīng)體系 GSHPx、CAT、Bcl-2和p 53的熒光定量RT－PCR反應(yīng)體系各成分及加樣量見表4。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min，進(jìn)行如下循環(huán)：95℃15 s，60℃15 s，72℃45 s；35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7 min，4℃保存。

1．7．5 RT－PCR產(chǎn)物的檢測(cè)與相對(duì)定量所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶，條件為：90 V，60 min，凝膠電泳成像系統(tǒng)成像，以50 bp Marker作對(duì)照檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)條帶大小是否與β-actin產(chǎn)物大小相同。本試驗(yàn)中將cDNA樣品進(jìn)行1，5，25，125，625，3125倍稀釋，對(duì)目的基因和內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以cDNA稀釋倍數(shù)取對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，△Ct值為縱坐標(biāo)作圖，得到回歸線Y＝0.0629X＋6.058，R2＝0.55，曲線斜率為0．0629，說明目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率基本一致，可以用2－△△Ct法計(jì)算本試驗(yàn)中基因相對(duì)表達(dá)量，即以對(duì)照組基因表達(dá)量為1倍，處理組表達(dá)量為相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)。

1．8 淋巴細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

將凍存的細(xì)胞放入水浴鍋（37℃）迅速解凍，1500 r／min離心10 min，吸除上清，加入1 m L冰浴預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1．5 m L離心管，再次離心并吸除上清，加入1 m L冰浴預(yù)冷的70%濃度的乙醇，反復(fù)吹打以避免細(xì)胞成團(tuán)，固定24 h后離心并棄去上清，加入1 m L冰浴預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心并吸除上清，加入0．5 m L碘化丙啶染色液（碧云天生物技術(shù)研究所）37℃避光孵育30 min后上流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，EPICS XL／-MCL）檢測(cè)。

1．9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行初步處理后，再使用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行成對(duì)樣本差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，檢驗(yàn)誤差為5%和1%水平。

2 結(jié)果與分析

2．1 復(fù)合中草藥制劑對(duì)奶牛產(chǎn)奶性能的影響

由表5可知，不同劑量復(fù)合中草藥制劑的添加對(duì)于維持奶牛的產(chǎn)奶量具有明顯的效果，雖然整體產(chǎn)奶量均較試驗(yàn)開始前有所下降，但3個(gè)試驗(yàn)組奶牛的產(chǎn)奶量分別比對(duì)照組高出20．26%（P＜0．05），24．20%（P＜0．05）和16．98%（P＞0．05），其中，B、C組達(dá)到顯著水平；復(fù)合中草藥制劑對(duì)乳脂率和乳蛋白率的影響不顯著（P＞0．05），但對(duì)乳中體細(xì)胞數(shù)影響顯著，B、C和D組分別較對(duì)照組降低了21．68%（P＜0．05），29．88%（P＜0．05）和24．22%（P＜0．05）。

2．2 復(fù)合中草藥制劑對(duì)奶牛血液抗氧化酶基因表達(dá)水平的影響

由表6可知，在添加復(fù)合中草藥制劑之前，各組奶牛血液GSH-Px基因的表達(dá)水平之間不存在顯著差異，添加了復(fù)合中草藥制劑之后，各試驗(yàn)組奶牛血液GSH-Px基因的表達(dá)水平均呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，3個(gè)試驗(yàn)組在第20和40天時(shí)的表達(dá)水平較對(duì)照組分別高出6．00%（P＞0．05），15．00%（P＞0．05），4．00%（P＞0．05）和10．00%（P＞0．05），22．00%（P＜0．05），10．00%（P＞0．05），其中C組在第40天時(shí)的漲幅達(dá)到顯著水平；從整個(gè)試驗(yàn)期的平均水平來看，3個(gè)試驗(yàn)組比對(duì)照組分別高出5．00%（P＞0．05），13．00%（P＜0．05）和6．00%（P＞0．05），C組達(dá)到顯著水平。說明復(fù)合中草藥制劑能有效提高熱應(yīng)激奶牛血液抗氧化酶GSH-Px基因的表達(dá)水平。

各組奶牛血液CAT基因的表達(dá)水平在添加復(fù)合中草藥制劑前不存在顯著差異（表6）。在試驗(yàn)的第20和40天，3個(gè)試驗(yàn)組奶牛血液CAT基因的表達(dá)水平較對(duì)照組分別升高了8．00%（P＞0．05），20．00%（P＞0．05），4．00%（P＞0．05）和9．00%（P＞0．05），26．00%（P＜0．05），6．00%（P＞0．05），其中，C組在第40天時(shí)及全期的增幅達(dá)到顯著水平。從全期的平均水平來看，3個(gè)試驗(yàn)組的漲幅分別達(dá)到5．00%（P＞0．05），16．00%（P＜0．05）和3．00%（P＞0．05），C組與對(duì)照組之間存在顯著差異。說明復(fù)合中草藥制劑在提高熱應(yīng)激奶牛血液抗氧化酶CAT基因的表達(dá)水平方面具有明顯的效果。

2．3 復(fù)合中草藥制劑對(duì)奶牛血液淋巴細(xì)胞凋亡率及其相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

由表7可知，各組奶牛血淋巴細(xì)胞凋亡率在試驗(yàn)開始之前不存在顯著差異，添加復(fù)合中草藥制劑之后，B、C組奶牛在第20天時(shí)的血淋巴細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著降低，降幅分別達(dá)到21．01%（P＜0．05）和23．64%（P＜0．05），到第40天時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)組奶牛的血淋巴細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組分別降低了27．45%（P＜0．01），27．36%（P＜0．01）和24．55%（P＜0．01），均達(dá)到極顯著水平；就整個(gè)試驗(yàn)期而言，3個(gè)試驗(yàn)組奶牛的血淋巴細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組分別降低了18．20%（P＞0．05），17．86%（P＞0．05）和12．51%（P＞0．05）。該結(jié)果表明復(fù)合中草藥制劑能有效降低熱應(yīng)激奶牛外周血淋巴細(xì)胞的凋亡率。

各組奶牛血淋巴細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)水平在試驗(yàn)開始之前不存在顯著差異（表8）。添加復(fù)合中草藥制劑后，3個(gè)試驗(yàn)組奶牛血淋巴細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá)水平較對(duì)照組相比均有不同程度的降低，其中，B、C組在第20及3個(gè)試驗(yàn)組在第40天時(shí)的增幅均達(dá)到極顯著水平（P＜0．01），D組在第20天時(shí)的增幅也達(dá)到顯著水平（P＜0．05），從整個(gè)試驗(yàn)期的平均水平來看，B、C和D組較對(duì)照組的增幅分別達(dá)到105．00%（P＜0．01），113．00%（P＜0．01）和57．00%（P＞0．05）。結(jié)果說明復(fù)合中草藥制劑對(duì)熱應(yīng)激奶牛血淋巴細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)水平的影響非常顯著。

各組奶牛血淋巴細(xì)胞p 53基因的表達(dá)水平在添加復(fù)合中草藥制劑之前不存在顯著差異。試驗(yàn)開始之后，B、C和D組在第20和40天時(shí)較對(duì)照組的降幅均達(dá)到極顯著水平（P＜0．01），就整個(gè)試驗(yàn)期的平均水平來看，3個(gè)試驗(yàn)組較對(duì)照組分別降低了24．00%（P＞0．05），28．00%（P＞0．05）和20．00%（P＞0．05）。說明復(fù)合中草藥制劑的添加能有效降低熱應(yīng)激奶牛血淋巴細(xì)胞p53基因的表達(dá)水平。

3 討論

3．1 復(fù)合中草藥制劑對(duì)熱應(yīng)激奶牛生產(chǎn)性能的影響

奶牛受熱應(yīng)激的影響，直腸溫度、呼吸頻率和脈搏等3項(xiàng)生理常數(shù)指標(biāo)均會(huì)顯著升高，這直接影響到奶牛的采食量，并最終導(dǎo)致產(chǎn)奶量的顯著下降［22］。在本研究中，測(cè)定的牛舍溫濕指數(shù)在整個(gè)試驗(yàn)期一直大于72，說明奶牛一直處于熱應(yīng)激狀態(tài)，各組奶牛的產(chǎn)奶量較試驗(yàn)開始前也出現(xiàn)了不同程度的降低，其中，對(duì)照組的降幅達(dá)到30．42%，而復(fù)合中草藥制劑的添加對(duì)維持奶牛的產(chǎn)奶量表現(xiàn)出一定的效果，3個(gè)試驗(yàn)組奶牛的產(chǎn)奶量較對(duì)照組分別高出了20．26%、24．20%和16．98%，這可能是由于復(fù)合中草藥制劑對(duì)奶牛熱應(yīng)激有較好的緩解作用［23］，能有效清除熱應(yīng)激產(chǎn)生的過量自由基［24］，增強(qiáng)奶牛機(jī)體抗氧化功能，進(jìn)而提高采食量，改善奶牛的產(chǎn)奶性能。其中，B、C組的乳蛋白率和B、D組的乳脂率較對(duì)照組有所降低，但由于日產(chǎn)奶量的提高幅度較大，因此，總的乳脂產(chǎn)量和乳蛋白產(chǎn)量仍然較對(duì)照組有明顯的升高；但D組的乳脂率和C組的乳蛋白率又較對(duì)照組有所提高，這可能是因?yàn)槟膛€(gè)體之間的差異以及奶牛在熱應(yīng)激條件下自行選擇采食的日糧結(jié)構(gòu)組成存在差異，比如青飼料和精料的比例不同。另外，3個(gè)試驗(yàn)組奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組分別降低了21．68%、29．88%和24．22%，說明復(fù)合中草藥制劑能對(duì)熱應(yīng)激奶牛起到一定的保健作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，抑制炎癥的發(fā)生。

3．2 復(fù)合中草藥制劑對(duì)熱應(yīng)激奶牛血液抗氧化酶基因表達(dá)水平的影響

基于抗氧化酶GSH-Px和CAT對(duì)機(jī)體抗氧化應(yīng)激的重要性，本研究探索了復(fù)合中草藥制劑對(duì)熱應(yīng)激奶牛血液GSH-Px和CAT基因表達(dá)的影響。GSH-Px、SOD和CAT一起構(gòu)成了生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)，機(jī)體對(duì)活性氧O2-的第1道防線是SOD，它將O2-轉(zhuǎn)化為過氧化氫和其他氫過氧化物；第2道防線是CAT和GSH-Px，其中CAT可清除過氧體系中的H2O2，而GSH-Px分布在細(xì)胞的胞液和線粒體中，可同時(shí)清除H2O2和氫過氧化物，從而有效地保護(hù)機(jī)體［25］。前人的研究表明，自由基數(shù)量的減少等能增強(qiáng)GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶基因的表達(dá)水平，進(jìn)而阻斷脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，緩解膜脂質(zhì)過氧化，提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力并減少細(xì)胞的損傷［26］。在本研究中，復(fù)合中草藥制劑的添加顯著提高了熱應(yīng)激奶牛血液GSH-Px和CAT基因的表達(dá)水平，說明奶牛的抗氧化能力得到了顯著提高。這是由于復(fù)合中草藥制劑中富含黃酮類、多酚類和鞣質(zhì)類化合物，黃酮類物質(zhì)能通過酚羥基與自由基生成穩(wěn)定的半醒自由基，通過抗氧化劑的還原作用直接給出電子而清除自由基；多酚類化合物是極好的氫或電子供體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不會(huì)引發(fā)新的游離基或者由于鏈反應(yīng)而被迅速氧化，所以有很好的抗氧化效果；而鞣質(zhì)類物質(zhì)的抗氧化性主要體現(xiàn)在其通過還原反應(yīng)降低環(huán)境中氧含量，或作為氫供體與環(huán)境中自由基結(jié)合，終止自由基引發(fā)的連鎖反應(yīng)［24］。復(fù)合中草藥制劑中的抗氧化類化合物共同作用，促進(jìn)過量自由基的清除，提高抗氧化酶基因的表達(dá)水平，并最終改善奶牛機(jī)體的抗氧化能力。

3．3 復(fù)合中草藥制劑對(duì)熱應(yīng)激奶牛血淋巴細(xì)胞凋亡率及其相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

有研究表明，熱應(yīng)激能顯著增加奶牛［27-28］和藏獒［29］外周血淋巴細(xì)胞的凋亡率，但在熱應(yīng)激初期奶牛具有一定的自身調(diào)節(jié)能力來減弱熱應(yīng)激反應(yīng)［30］。在本研究中，試驗(yàn)期的奶牛一直處于熱應(yīng)激狀態(tài)下，熱應(yīng)激對(duì)奶牛淋巴細(xì)胞造成了極大的損傷，對(duì)照組奶牛在試驗(yàn)第20和40天時(shí)的淋巴細(xì)胞凋亡率分別比試驗(yàn)開始前升高了101．96%和116．11%，3個(gè)試驗(yàn)組奶牛的淋巴細(xì)胞凋亡率也較試驗(yàn)開始前有所升高，但復(fù)合中草藥制劑的添加對(duì)于降低淋巴細(xì)胞的損傷還是表現(xiàn)出了顯著的效果，凋亡率的平均水平較對(duì)照組分別降低了18．20%，17．86%和12．51%。Bcl-2是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的抗凋亡基因，能夠有效延長(zhǎng)細(xì)胞周期［31］；p53調(diào)控一些僅有BH3區(qū)域的蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能十分顯著［32-33］。p 53作為促細(xì)胞凋亡因子，其高表達(dá)能減少Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而Bcl-2又能抑制p 53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。當(dāng)p 53基因失活時(shí)，引起B(yǎng)cl-2家族基因調(diào)控失衡，凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)水平升高，導(dǎo)致靶細(xì)胞不易誘發(fā)細(xì)胞凋亡［34］，因而p53與Bcl-2家族基因的調(diào)控作用是相互聯(lián)系的。在本研究中，復(fù)合中草藥制劑的添加有效地降低了p53基因的表達(dá)并增加了Bcl-2基因的表達(dá)，因此，能有效的降低淋巴細(xì)胞的凋亡率，增強(qiáng)奶牛機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫能力，并最終減輕熱應(yīng)激對(duì)奶牛機(jī)體造成的損傷。

3．4 復(fù)合中草藥制劑的劑量效應(yīng)

在本研究中，綜合考慮各指標(biāo)，給每頭牛添加100 g／d水平復(fù)合中草藥制劑的效果要好于50和150 g／d水平。總結(jié)其原因，100 g／d添加水平效果要優(yōu)于50 g／d添加水平的原因可能是因?yàn)?0 g／d的添加劑量還略為偏低，雖然也有比較明顯的效果，但還是趕不上100 g／d添加水平的效果；而150 g／d添加水平的效果不如100 g／d添加水平的原因可能是由于中草藥添加劑有一定的苦味，在炎熱的天氣條件下，較高劑量的攝入對(duì)奶牛會(huì)產(chǎn)生味覺上的刺激，會(huì)使奶牛機(jī)體產(chǎn)生一定程度的應(yīng)激，盡管如此，它起到的正向功效還是不容忽視的。從實(shí)際使用效果及經(jīng)濟(jì)收益方面來考慮，每頭牛100 g／d的添加水平最為適宜。

4 結(jié)論

復(fù)合中草藥制劑能有效改善熱應(yīng)激條件下奶牛的泌乳性能；復(fù)合中草藥制劑能通過提高GSH-Px和CAT基因的表達(dá)水平在一定程度上改善奶牛機(jī)體的抗氧化性能；復(fù)合中草藥制劑能通過提高Bcl-2的表達(dá)水平并降低p53基因的表達(dá)水平來抑制熱應(yīng)激奶牛外周血淋巴細(xì)胞的凋亡率，進(jìn)而改善奶牛機(jī)體的免疫功能；在本研究條件下，給每頭牛添加100 g／d水平的效果最好。

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Effect of Chinese herbal medicine on milk production，antioxidant capacity and immunity of dairy cows

HU Yongling1*，YE Shili2，LUO Jiajie3
1.Hunan Environmental Biological Vocational and Technical College，Hengyang 421005，China；2.Hengyang Fukuang Feed Ad ditive Company，Hengyang 421004，China；3.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China

The effect of compound Chinese herbal medicine on milk performance，antioxidant capacity and immunity of dairy cows was studied in 20 healthy mid to late lactation Chinese Holstein cows．Based on lactationtime and milk yield，cows were divided into four equal size groups（A，B，C and D）．Group A（control）was feed the base diet only（no herbal medicine），whereas group B，C and D were feed the basal diet supplemented with 50，100 and 150 g／d of the Chinese herbal medicine，respectively．The milk yield for each cow was measured daily．Blood samples for each cow under heat stress conditions were collected on the 1st，20th and 40th day following implementation of treatments to determine apoptosis rate of lymphocytes，GSH-Px，and gene expression of CAT and lymphocyte apoptosis related gene，Bcl-2，p53．Cows in group B，C and D produced 20．26%，24．20%and 16．98%more milk than those in group A（P＜0．05），respectively．The somatic cell counts in milk from group B，C and D were 21．68%，29．88%and 24．22%（P＜0．05）lower than that group A，respectively．The mean level of GSH-Px and CAT gene expression in group B，C and D was greater than that in group A by 5．00%（P＞0．05），13．00%（P＜0．05），6．00%（P＞0．05）and 5．00%（P＞0．05），16．00%（P＜0．05），3．00%（P＞0．05），respectively．The apoptosis rate of lymphocyte in cows from group B，C and D were 18．20%（P＞0．05），17．86%（P＞0．05）and 12．51%（P＞0．05）lower than those in group A，respectively．The expression level of Bcl-2 in group B，C and D was 105．00%（P＞0．05），113．00%（P＞0．05）and 57．00%（P＞0．05）higher than that in group A，respectively．Additionally，the expression level of p53 gene in groups B，C and D were 24．00%（P＞0．05），28．00%（P＞0．05）and 20．00%（P＞0．05）lower than that in the control group，respectively．The gene expression level of Bcl-2 and p53 was significantly higher in groups（B，C and D）than that in control group after 20 and 40 days．Within the groups receiving Chinese medicine，milk yield，somatic number，antioxidase activity and expression level of lymphocytic apoptosis related genes were higher in group C than other groups，while the apoptosis rate of lymphocyte in group B was highest．This study suggested that compound Chinese herbal medicine can improve milk performance，antioxidant capacity and immunity of dairy cattle under heat stress．

dairy cattle；Chinese herbal medicine；milk performance；antioxidant capacity；immunity

10．11686／cyxb20150117 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

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2014-05-12；改回日期：2014-07-18

國(guó)家教育部、財(cái)政部支持的國(guó)家重點(diǎn)專業(yè)建設(shè)項(xiàng)目［2011（71）］和湖南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（11C0468）資助。

胡永靈（1969-），男，湖南衡陽人，副教授，碩士。E-mail：huyonglin19＠163．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：962567227＠qq．com