張 廣 昊，董 天 飛，陳 明，高 子 晴，張 春 枝

（1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.赤峰工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024005）

0 引 言

A40926 是由野野村放線菌（Nonomuraeasp.）ATCC 39727產(chǎn)生的新型天然脂糖肽類抗生素，生物活性顯著，能夠有效抑制革蘭氏陽性耐藥菌［1］。以A40926為前體制備的新型半合成脂糖肽抗生素Dalbavancin目前正處于Ⅲ期臨床研究階段［2］。A40926為一組結(jié)構(gòu)相近的因子組成的復(fù)合物，其中各因子均含有交聯(lián)七肽架構(gòu)、2個(gè)氯原子、一個(gè)甘露糖和一個(gè)疏水脂酰側(cè)鏈，區(qū)別在于疏水脂酰側(cè)鏈不同［1，3－4］。研究表明，疏水脂酰側(cè)鏈的引入顯著增強(qiáng)了脂糖肽類抗生素的抗菌活性，延長了藥物在生物體內(nèi)的滯留時(shí)間［5－6］。

Nonomuraeasp.ATCC 39727體內(nèi)A40926疏水脂酰側(cè)鏈來源的研究引起人們很大的興趣，然而對(duì)參與A40926 合成的基因簇（命名為dbv基因）功能分析，發(fā)現(xiàn)其中并不包含疏水脂酰長鏈的合成基因［7］。Beltramatti［8］和Jovetic［9］等研究發(fā)現(xiàn)，生成A40926各因子的比例和Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞脂肪酸組成在量上存在相關(guān)性，推測(cè)可能是細(xì)胞長鏈脂肪酸經(jīng)β－氧化縮短后生成了A40926因子的脂酰側(cè)鏈。

為進(jìn)一步探究Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞脂肪酸和A40926因子的脂酰側(cè)鏈之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，首先需要對(duì)Nonomuraeasp.細(xì)胞脂肪酸組成進(jìn)行分析。野野村放線菌Nonomuraeasp.ATCC 39727 作為一個(gè)微生物新種，對(duì)其菌種特性的研究報(bào)道目前尚不多見［10－11］。本研究利用氣質(zhì)聯(lián)用色譜（GC－MS）對(duì)Nonomuraeasp.ATCC 39727 脂肪酸組成進(jìn)行分析，建立了Nonomuraeasp.ATCC 39727 脂肪酸的分析方法，為進(jìn)一步闡明Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞脂肪酸和A40926脂酰側(cè)鏈之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌 種

A40926 產(chǎn)生菌Nonomuraeasp.ATCC 39727，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院陳少欣研究員饋贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

ISP2斜面及平板培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖4.0，酵母提取物4.0，麥芽提取物10.0，瓊脂20.0，pH 7.0。

液體培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖4.0，酵母提取物4.0，麥芽提取物10.0，pH 7.0。

1.3 菌體培養(yǎng)

將菌種Nonomuraeasp.ATCC 39727稀釋涂布至ISP2平板培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中于28 ℃培養(yǎng)7～8d，挑取單菌落至裝有玻璃珠和2 mL 無菌水的試管中，振蕩破碎菌體，將菌懸液接入裝有25mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置28 ℃振蕩培養(yǎng)48h，搖床轉(zhuǎn)速為180r／min。

1.4 細(xì)胞脂肪酸的甲酯化

將培養(yǎng)后的菌體培養(yǎng)液于4 000r／min離心5min，棄上清，將菌體沉淀用5 mL 1 mol／L NaOH－MeOH 溶液分兩次轉(zhuǎn)移至25mL 具塞試管中，置70 ℃水浴下皂化30 min，加入5 mL 14%BF3－MeOH 溶液，70 ℃水浴下甲酯化反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后加入5 mL 飽和NaCl溶液及2mL正己烷，手動(dòng)振蕩混勻，靜置，取上層有機(jī)相于4 000r／min離心5min，吸取上層有機(jī)相用于GC－MS分析。

1.5 GC－MS分析

氣質(zhì)聯(lián)用儀為Agilent Technologies 7890型氣相色譜－5975 型質(zhì)譜聯(lián)用儀。氣相色譜條件為：HP－5MS彈性石英毛細(xì)管色譜柱（5%苯甲基硅氧烷，30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度，250 ℃；載氣，高純度氦氣；體積流量，1mL／min，進(jìn)樣量；1μL；分流比，1∶10；柱溫采取程序升溫：初始溫度100℃，維持4min，以4℃／min升溫至250 ℃，維持5min。質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊源（EI）；電子能量為70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍為m／z35～450，Scan全掃描方式。

2 結(jié)果與討論

2.1 總離子流色譜圖

Nonomuraeasp.ATCC 39727 經(jīng)液體培養(yǎng)增殖后，收集菌體細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞中脂肪酸進(jìn)行甲酯化處理，衍生后所得的脂肪酸甲酯（FAME）進(jìn)行GC－MS分析，圖1 為Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞脂肪酸的總離子色譜圖。對(duì)總離子色譜圖的各色譜峰選擇美國國家標(biāo)準(zhǔn)研究所（NIST）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行檢索分析，結(jié)果表明脂肪酸甲酯對(duì)應(yīng)的色譜峰保留時(shí)間為24～33min，共檢出12種脂肪酸，各脂肪酸甲酯色譜峰的保留時(shí)間如圖1所示。

圖1 Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞脂肪酸的總離子色譜圖Fig.1 Total ions chromatograph profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727fatty acids

2.2 主要脂肪酸

由圖1 可知，A40926 產(chǎn)生菌Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞脂肪酸中含量較高的脂肪酸有4種，其甲酯化衍生物對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間分別為26.740、27.130、27.655和31.741 min。將4種脂肪酸甲酯的質(zhì)譜圖在NIST 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫中進(jìn)行檢索，根據(jù)檢索結(jié)果可以確定分別為iso－C16：0、n－C16：1△7、n－C16：0、n－C18：1△9脂肪酸的甲酯化衍生物，鑒定結(jié)果見圖2。

圖2 Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞中4種主要脂肪酸的甲酯化衍生物質(zhì)譜圖Fig.2 Methyl esterified derivatives of four main fatty acids of Nonomuraea sp.ATCC 39727

2.3 其他脂肪酸

除4種主要脂肪酸外，本研究從A40926 產(chǎn)生菌Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞脂肪酸中還鑒定出其他8 種脂肪酸，分別為iso－C15：0（Rt 24.189 min）、n－C15：0（Rt 25.143 min）、n－C17：0 10－Met（Rt 28.705 min）、anteiso－C17：0（Rt 29.384 min）、n－C17：1△7（Rt 29.481 min）、iso－C17：0（Rt 30.039 min）、n－C18：0 14－Met（Rt 30.998min）、n－C18：0（Rt 32.335min）脂肪酸。

2.4 脂肪酸組分含量的測(cè)定

根據(jù)圖1并采用峰面積歸一法處理得到各組分的分析結(jié)果如表1 所示。Nonomuraeasp.ATCC 39727 細(xì)胞中以偶數(shù)碳的直鏈脂肪酸為主，以n－C16：0脂肪酸含量最高，達(dá)到39.563%，而n－C16：1△7、n－C16：0、n－C18：1△9、n－C18：0等4種偶數(shù)碳直鏈脂肪酸含量高達(dá)細(xì)胞脂肪酸含量的70.919%；偶數(shù)碳支鏈脂肪酸在Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞中也占有較高的比例，iso－C16：0脂肪酸含量達(dá)到9.286%；Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞中奇數(shù)碳脂肪酸包括iso－C15：0、n－C15：0、n－C17：0 10－Met、anteiso－C17：0、n－C17：1△7、iso－C17：0等6種脂肪酸，但其含量相對(duì)較低，奇數(shù)碳脂肪酸含量占細(xì)胞脂肪酸含量的17.826%。

Wallace等［12］利用同位素標(biāo)記的脂肪酸合成起始物研究了放線菌體內(nèi)的脂肪酸生物合成，結(jié)果表明，丁酰CoA 和丙酰CoA 為細(xì)胞直鏈脂肪酸的合成起始物，分別導(dǎo)致生成偶數(shù)碳n－脂肪酸、奇數(shù)碳n－脂肪酸，而異丁酰CoA、3－甲基丁酰CoA 和2－甲基丁酰CoA 為細(xì)胞支鏈脂肪酸的合成起始物，分別導(dǎo)致生成偶數(shù)碳iso－脂肪酸、奇數(shù)碳iso－脂肪酸、奇數(shù)碳anteiso－脂肪酸。Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞中以偶數(shù)碳的直鏈脂肪酸為主，而奇數(shù)碳脂肪酸含量較低，可以推測(cè)Nonomuraeasp.ATCC 39727 在本研究培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)丁酰CoA 的含量相對(duì)較高，而且丁酰CoA 與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成酶系的親和力較強(qiáng)。

表1 Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞脂肪酸組成Tab.1 Composition of Nonomuraeasp.ATCC 39727 fatty acids analyzed as FAMEs by GC－MS

3 結(jié) 論

利用GC－MS對(duì)脂糖肽類抗生素A40926產(chǎn)生菌Nonomuraeasp.ATCC 39727的細(xì)胞脂肪酸進(jìn)行分析，共檢出12種脂肪酸，其中主要脂肪酸 包 括iso－C16：0、n－C16：1△7、n－C16：0、n－C18：1△9脂肪酸，以n－C16：0脂肪酸含量最高，達(dá)到39.563%。Nonomuraeasp.ATCC 39727細(xì)胞中以偶數(shù)碳的直鏈脂肪酸為主，而奇數(shù)碳脂肪酸（C15、C17）含量較低，細(xì)胞脂肪酸的組成反映了一定培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成起始物的豐度以及合成起始物與脂肪酸合成酶系的親和程度。

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