張?zhí)鞐?，劉春瑩，魚(yú)紅閃，金鳳燮(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連　116034 )

一種霉菌產(chǎn)的人參皂苷酶水解Rb1和Rb2皂苷糖基的機(jī)理

張?zhí)鞐?，劉春瑩，魚(yú)紅閃，金鳳燮
(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034 )

摘要:利用TLC法確定了一種霉菌產(chǎn)的特異人參皂苷酶水解Rb1和Rb2人參皂苷糖基的機(jī)理。結(jié)果表明，水解人參皂苷Rb1和Rb2的糖基種類(lèi)和位置不同。水解Rb1皂苷時(shí)，先水解其20-O-β-(1→6) -葡萄糖苷鍵生成Rd，再依次水解Rd上2個(gè)3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷鍵生成F2及終產(chǎn)物C-K;但在水解Rb2時(shí)，先水解其3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷鍵生成C—O，再依次水解3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷鍵和20-O-α-(1→6) -阿拉伯糖苷鍵生成C-Y和C-K。

關(guān)鍵詞:特異人參皂苷酶;人參皂苷Rb1、Rb2;薄層層析法

0　引言

人參皂苷是人參的主要活性成分之一。天然存在的人參皂苷不一定是人參的最佳藥效成分，需經(jīng)腸道菌將其轉(zhuǎn)化成活性更佳的成分，但這種轉(zhuǎn)化受個(gè)體體質(zhì)的限制明顯［1］。本課題組多年致力于研究人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化，已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了多種人參皂苷酶［2-4］。本論文旨在通過(guò)研究人參皂苷Rb1和Rb2在人參皂苷酶作用下的水解機(jī)理，為今后人參皂苷的定向轉(zhuǎn)化奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1、Rb2、Rd、C-O、F2、C-Y、C-K，本實(shí)驗(yàn)室提供;霉菌產(chǎn)人參皂苷酶，本實(shí)驗(yàn)室提供;薄層層析板Silica gel 60-F254;高效液相色譜儀。

1.2方法

1.2.1酶的提純

將該種霉菌發(fā)酵所產(chǎn)的粗酶，通過(guò)DE-52離子交換樹(shù)脂分離純化后，將酶活力高的組分在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中進(jìn)一步純化。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，電壓120 V，考馬氏亮藍(lán)染色。對(duì)照染色后的膠，將在未染色的凝膠上該酶帶的位置割下，搗碎溶于0.02 mol磷酸緩沖液(pH 6.7)，離心除去不溶性沉淀，獲得的酶利用SDS-PAGE法確定電泳單點(diǎn)，再用高效液相色譜法確定是否單峰，確定為純酶。

利用Waters 2695高效液相色譜分析儀，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器及Empower色譜工作站檢測(cè)蛋白;色譜柱，日本TOSOH TSK(Φ7.8 mm ×300 mm)流動(dòng)相為0.02 mol/L(pH 6.7)磷酸緩沖液(含0.05%疊氮化鈉)。進(jìn)樣量，100 μL;柱溫，35℃;體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)，280 nm。

用SDS-PAGE法測(cè)定該酶的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.2底物的配制

稱取110 mg的人參皂苷Rb1，溶于5 mL的已滅菌過(guò)的0.02 mol、pH 5.0的NaAc-HAc緩沖液，配制成20 mmol/L的Rb1底物溶液。同樣方法配制Rb2底物溶液。

1.2.3酶反應(yīng)

將2 mL底物與等體積的純酶溶液混合，置于45℃條件下?lián)u床反應(yīng)，按不同時(shí)間，取200 μL酶反應(yīng)液，并向其中加入等體積的水飽和正丁醇，終止酶反應(yīng)，將反應(yīng)物、產(chǎn)物轉(zhuǎn)入正丁醇層。經(jīng)薄層層析顯色后，用Bandscan軟件測(cè)定反應(yīng)物和產(chǎn)物斑點(diǎn)比例，確定酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率(產(chǎn)物含量)。

1.2.4人參皂苷的檢測(cè)方法

薄層層析法:反應(yīng)液的正丁醇層(皂苷組分)，在硅膠板上點(diǎn)樣，層析缸中展開(kāi)，展開(kāi)劑V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶2.5∶0.5(下層) ;展開(kāi)后噴10%硫酸溶液，加熱顯色;確定酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

高效液相色譜法:將Rb1和Rb2反應(yīng)液(水飽和正丁醇層)蒸干，稱取1 mg溶于色譜甲醇，再經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)備進(jìn)樣。色譜柱，Knauer C18(5 μm，Φ250 mm×3 mm)。流動(dòng)相:乙腈(A) -水(B) ;流動(dòng)相比例: 0～20 min，20% A等度; 20～31 min，20%～32% A線性梯度; 31～40 min，32%～43% A線性梯度; 40～70 min，43%～100%A線性梯度;進(jìn)樣量，30 μL;柱溫，35℃，體積流量; 0.6 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)，203 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1酶的提純

經(jīng)SDS-PAGE法初步檢測(cè)，得到單一條帶;經(jīng)酶蛋白高效液相色譜測(cè)定，得到單一峰，說(shuō)明該酶為純酶，相對(duì)分子質(zhì)量為74 ku。

2.2Rb1水解機(jī)理

薄層層析顯色結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，Rb1幾乎全部被水解，主要產(chǎn)物為Rd、F2和C-K等，與實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果一致。經(jīng)Bandscan軟件測(cè)定，3種物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為52%、21.7%和26.3%。由此可知，酶水解Rb1的反應(yīng)式如圖2所示。由圖2可推斷出，人參皂苷Rb1在特異人參皂苷酶的作用下糖基水解的機(jī)制為:首先水解Rb1上的20-O-β-(1→6) -葡萄糖苷鍵生成Rd，再水解Rd上3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷鍵生成人參皂苷F2，接著水解F2上的3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷鍵生成C-K。

圖1　特異人參皂苷酶水解Rb1的TLC圖Fig.1 TLC of Rb1hydrolyzed by special ginsenosidase

圖2　特異人參皂苷酶水解Rb1的反應(yīng)式Fig.2 Reaction formula of Rb1hydrolysis by special ginsenosidase

2.3Rb2水解機(jī)理

薄層層析顯色結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，反應(yīng)物中主要含有未反應(yīng)的Rb2、產(chǎn)物C-O、C-Y和少量的C-K;經(jīng)Bandscan軟件測(cè)定，它們質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為39.8%、27.47%、29.55%和3.18%。

圖3　特異人參皂苷酶水解Rb2的TLC圖Fig.3 TLC of Rb2hydrolyzed by special ginsenosidase

利用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，反應(yīng)物中主要含有未反應(yīng)的Rb2、產(chǎn)物C-O、C-Y和少量的C-K;其Rb2、C-O、C-Y、C-K峰面積比與TLC結(jié)果相似。由此可見(jiàn)，人參皂苷Rb2在特異人參皂苷酶的作用下，其糖基水解的機(jī)制為:首先水解Rb2上的3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷鍵生成C-O，再水解C-O的3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷鍵生成C-Y，接著進(jìn)一步水解C-Y上的20-O-α-(1→6) -阿拉伯糖苷鍵生成CK。其反應(yīng)過(guò)程如圖5所示。

圖4　Rb2水解產(chǎn)物的HPLC圖Fig.4 HPLC of Rb2hydrolysis products

圖5　特異人參皂苷酶水解Rb2的反應(yīng)式Fig.5 Reaction formula of Rb2hydrolysis by special ginsenosidase

3　結(jié)論

特異人參皂苷酶水解Rb1和Rb2最終生成C-K途徑不同，水解Rb1時(shí)先水解20-O-糖基，水解Rb2時(shí)先水解3-O-糖基;但是該酶能水解Rb1和Rb2的多種糖基，屬于人參皂苷酶I型。

參考文獻(xiàn):

［1］李翠翠，莊子瑜，劉廷強(qiáng)，等.轉(zhuǎn)化人參二醇類(lèi)皂苷為C-K的特異人參皂苷糖苷酶的純化及性質(zhì)［J］.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29(1) :11-14.(LI Cui-cui，ZHUANG Zi-yu，LIU Ting-qiang，et al.Purification and characterization of the special ginsenosidase transforming protopanaxadiol ginsenosides into ginsenoside C-K［J］.Journal of Dalian Polytechnic University，2010，29(1) :11-14.)

［2］金贊敏，魚(yú)紅閃，金鳳燮.人參皂甙-α-鼠李糖苷酶分離提純及其酶性質(zhì)［J］.大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，22(2) :103-106.(JIN Zan-min，YU Hong-shan，JIN Feng-xie.Purification and characterization of ginsenoside-α-rhanmosidase ［J］.Journal of Dalian Institute of Light Industry，2003，22(2) :103-106.)

［3］YU Hongshan，ZHANG Chunzhi，LU Mingchun，et al.Purification and characterization of new special ginsenosidase hydrolyzing multi-glycisides of protopanaxadiol ginsenosides，ginsenosidase typeⅠ［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2007，55(2) :231-235.

［4］YU Hongshan，JIN Fengxie，WANG Dongming，et al.Kinetics of a cloned special ginsenosidase hydrolyzing 3-O-glucoside of multi-protopanaxadiol-type ginsenosides，named ginsenosidase typeⅢ［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2012，22(3) :343-351.

Hydrolysis of glycosides in Rb1and Rb2by ginsenosidase from a mold strain

ZHANG Tianyang，LIU Chunying，YU Hongshan，JIN Fengxie
(School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China )

Abstract:The hydrolysis mechanisms of Rb1and Rb2by ginsenosidase from a mold strain were determined by TLC.The results showed that enzyme hydrolysis were related with the glycosides types and position on ginsenoside Rb1and Rb2.When hydrolyzing Rb1，the enzyme firstly hydrolyzed 20-O-β-(1→6) -glucopyranoside bond of Rb1to Rd，then hydrolyzed 3-O-β-(1→2) -glucopyranoside of Rd to F2，final to C-K.But the enzyme hydrolyzed 3-O-β-(1→2) -glucopyranoside of Rb2to C-O，then to C-Y，finally hydrolyzed 20-O-α-(1→6) -arabinoside of C-Y to C-K when hydrolyzing Rb2.

Key words:biotransformation; special ginsenosidase; ginsenoside Rb1and Rb2;TLC

作者簡(jiǎn)介:張?zhí)鞐?1987-)，女，碩士研究生;通信作者:金鳳燮(1945-)，男，教授.

基金項(xiàng)目:“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09503001-003).

收稿日期:2014-04-10.

文章編號(hào):1674-1404(2015) 03-0160-03

中圖分類(lèi)號(hào):TS201.2; Q946.83

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A