丁佳利，魏星鑫，任小鳳

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化哈蟆油腺嘌呤提取工藝

丁佳利1*，魏星鑫2，任小鳳2

目的 采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選哈蟆油中腺嘌呤的提取工藝。方法 采用HPLC測定腺嘌呤含量，以Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)為色譜柱，流動相甲醇-水，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。以腺嘌呤為考察指標(biāo)，通過星點設(shè)計-效應(yīng)面法考察甲醇濃度、提取時間、提取溫度對哈蟆油腺嘌呤提取工藝的影響。結(jié)果 腺嘌呤對照品進(jìn)樣量在17.73～110.33 μg/mL呈良好線形關(guān)系，回歸方程為Y=0.104 5 X+0.100 1，R2=0.999 6，平均回收率為97.84%，RSD為1.76%(n=6)。最佳提取工藝為甲醇濃度73%，提取時間68 min，提取溫度61 ℃，哈蟆油得率為465.30 μg/g。結(jié)論 優(yōu)選的哈蟆油腺嘌呤提取工藝簡便、穩(wěn)定。

哈蟆油；腺嘌呤；星點設(shè)計-效應(yīng)面法；HPLC；提取工藝

0 引言

哈蟆油(Oviductus ranae)為蛙科動物中國林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙輸卵管經(jīng)采制干燥而得[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并列為上品，《本草綱目》中稱之“山哈”，別名哈士蟆油、哈蟆、雪蛤，富有滋補(bǔ)“軟黃金”的美譽[2]。哈蟆油成分豐富，主要含有多糖、維生素、蛋白質(zhì)[3]、磷脂、脂肪[4]、蛙醇、脂肪酸、膽固醇[5]、微量元素[6]、人體必需氨基酸和激素等。藥理研究表明，哈蟆油具有抗缺氧、抗衰老[7]、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂、鎮(zhèn)咳祛痰和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。

腺嘌呤作為一種重要的核苷類成分，是生物遺傳信息的組成部分，還是ATP、多種酶的輔因子(如乙酰輔酶A、輔酶A轉(zhuǎn)移酶等)及細(xì)胞通訊媒介的必需部分，在細(xì)胞的生長、分裂和蛋白質(zhì)的合成過程中起著關(guān)鍵作用[8-9]；其磷酸鹽有刺激白細(xì)胞增生的作用，用于防治各種原因引起的白細(xì)胞減少癥，特別是由于腫瘤化療、放射治療及苯類等藥物中毒所造成的白細(xì)胞減少癥[10]。

本試驗采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選哈蟆油中腺嘌呤的提取工藝，以腺嘌呤得率為響應(yīng)值，使用Design-Expert 8.0.6軟件分析，優(yōu)化提取溶劑甲醇的濃度、提取時間和提取溫度。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Dionex UltiMate 3000高效液相色譜儀，配置包括四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、恒溫柱溫箱、DAD檢測器，變色龍色譜數(shù)據(jù)工作站；Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm ×4.6 mm,5.0 μm)色譜柱；梅特勒XS-105電子分析天平(0.01 mg，METTLER TOLEDO，Switzerland)；R-201恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)。

1.2 試藥 哈蟆油(批號：140601；產(chǎn)地：東北)購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，哈蟆油于液氮中研細(xì)保存?zhèn)溆?；腺嘌呤對照?批號：110886-201102；含量：99.4%)購自中國藥品生物制品檢定所；提取用甲醇為分析純，水為娃哈哈純凈水，液相用甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 哈蟆油腺嘌呤提取單因素考察 試驗首先考察影響哈蟆油腺嘌呤提取各單因素之間的水平差異，再篩選相關(guān)因素并合理設(shè)計因素水平，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2 甲醇濃度在哈蟆油腺嘌呤提取中的影響 稱取哈蟆油粉約0.1 g，精密加入水，20%、40%、60%、80%甲醇和甲醇溶液各15 mL，于60 ℃條件下水浴加熱提取60 min，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測定分析，結(jié)果見圖1。

圖1 甲醇濃度在哈蟆油腺嘌呤提取中的影響

由圖1可知，水作為溶劑提取哈蟆油腺嘌呤得率為303.68 μg/g，20%、40%甲醇相較于水得率略微升高，但無明顯變化。60%甲醇提取哈蟆油腺嘌呤得率達(dá)到最高值為472.14 μg/g，隨著甲醇濃度的升高，提取效果也逐漸減弱，甲醇得率最低為202.45 μg/g，故選取40%、60%、80%三個濃度的甲醇溶液進(jìn)行優(yōu)化試驗。

2.3 料液比在哈蟆油腺嘌呤提取中的影響 稱取哈蟆油粉約0.1 g，分別以料液比1∶25、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250精密加入60%甲醇溶液，于60 ℃條件下水浴加熱提取60 min，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測定，結(jié)果見圖2。

試驗過程中觀察到，哈蟆油具有很強(qiáng)的膨脹性。在料液比1∶25條件下，未能對哈蟆油腺嘌呤充分提取。隨著料液比的增大，哈蟆油腺嘌呤的得率漸漸增加，在1∶150下達(dá)到466.31 μg/g，而隨著料液比的繼續(xù)增大，無明顯變化，故試驗以料液比1∶150進(jìn)行試驗。

圖2 料液比在哈蟆油腺嘌呤提取中的影響

2.4 提取時間在哈蟆油腺嘌呤提取中的影響 稱取哈蟆油粉0.1 g，精密加入60%甲醇溶液15 mL，于60 ℃水浴加熱提取15、30、60、90、120、150 min，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測定，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間在哈蟆油腺嘌呤提取中的影響

由圖3可知，提取15 min，哈蟆油腺嘌呤得率為228.31 μg/g，在60 min時達(dá)到最高值476.08 μg/g，但隨著提取時間的繼續(xù)增加，哈蟆油腺嘌呤得率反而下降，故試驗選取30、60、90 min三個時間水平進(jìn)行優(yōu)化試驗。

2.5 提取溫度在哈蟆油腺嘌呤提取中的影響 稱取哈蟆油粉0.1 g，精密加入60%甲醇溶液15 mL，分別于40、50、60、70、80、90 ℃條件下水浴加熱提取60 min，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測定，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在40 ℃時，哈蟆油腺嘌呤得率為360.38 μg/g，隨著溫度的升高，腺嘌呤得率先相應(yīng)增大，在60 ℃時達(dá)到475.36 μg/g，但隨著溫度的繼續(xù)升高，腺嘌呤得率減小，在90 ℃時為373.62 μg/g，故試驗選取50、60、70 ℃三個溫度水平進(jìn)行優(yōu)化試驗。

圖4 提取溫度在哈蟆油腺嘌呤提取中的影響

2.6 星點設(shè)計-效應(yīng)面法

2.6.1 試驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇甲醇濃度、提取時間、提取溫度為自變量，每個因素取3個水平，因素水平編碼見表1，試驗安排及結(jié)果見表2。

表1 哈蟆油腺嘌呤提取工藝星點因素水平

表2 哈蟆油腺嘌呤提取工藝星點試驗安排

2.6.2 建立模型方程與顯著性檢驗 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到甲醇濃度、提取時間、提取溫度與哈蟆油腺嘌呤得率之間的二次多項回歸方程：Y=475.022+20.962 5 X1+17.057 5 X2+8.622 5 X3+9.452 5 X1X2-2.577 5 X1X3-6.497 5 X2X3-76.519 75 X12-42.534 75 X22-29.444 75 X32(R2=97.74%)，對上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

表3回歸方差顯著性檢驗表明，甲醇濃度(X1)、提取時間(X2)的線性效應(yīng)和二次效應(yīng)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明在提取條件中，甲醇濃度和提取時間的變差會在一定程度上影響哈蟆油腺嘌呤得率的變化。

2.6.3 響應(yīng)面分析及最優(yōu)提取條件的確定 采用Design-Expert 8.0.6軟件，依據(jù)回歸方程來繪制響應(yīng)面立體分析圖及等高線，考察所擬合的響應(yīng)面曲線的形狀，三因素交互作用的響應(yīng)面等高線及響應(yīng)面立體圖，如圖5、圖6所示。利用該圖可以對哈蟆油腺嘌呤得率的條件中任何2種因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析和評價。與之對應(yīng)的實測值為甲醇濃度X1=73.16%，提取時間X2=68.03 min，提取溫度X3=60.89 ℃，此時哈蟆油腺嘌呤得率最大估計值為459.12 μg/g。因此，確定哈蟆油中腺嘌呤的最佳提取工藝為甲醇濃度73%，提取時間68 min，提取溫度61 ℃。

2.6.4 驗證性試驗 稱取哈蟆油粉約0.1 g，6份，分別精密加入73%甲醇溶液15 mL于61 ℃水浴中加熱提取68 min，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測定，測得哈蟆油腺嘌呤得率分別為464.38、458.62、469.77、472.18、466.46、460.39 μg/g，平均值為465.30 μg/g，RSD值為1.13%。驗證結(jié)果與預(yù)測結(jié)果較接近，說明該工藝可行。

3 哈蟆油腺嘌呤的HPLC測定

3.1 色譜條件 采用島津 Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)色譜柱。以甲醇(A)-水溶液(B)為流動相梯度洗脫，具體如下：0～10 min，1%～5% A；10～15 min，5%～15% A；15～20 min，15%～20% A；20～30 min，20% A；30～35 min，20%～35% A；35～40 min，35%～1% A。流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長260 nm，進(jìn)樣量為10 μL，腺嘌呤對照品及哈蟆油樣品色譜圖如圖7所示。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取腺嘌呤對照品4.44 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，搖勻，為儲備液。將儲備液依次用甲醇稀釋制備成17.73、20.07、44.13、88.27、110.33 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測定。

表3 回歸模型方差分析

圖5 優(yōu)化工藝模型的等高線疊加圖

圖6 X1、X2、X3對腺嘌呤提取影響的效應(yīng)面圖

3.3 供試品溶液的制備 稱取哈蟆油粉約0.1 g，精密加入73%甲醇溶液15 mL于61 ℃水浴中加熱提取68 min，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測定。

3.4 線性關(guān)系考察 按“3.1”項下色譜條件，依次吸取17.73、20.07、44.13、88.27、110.33 μg/mL的腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，以腺嘌呤吸收峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X,μg/mL)進(jìn)行線形回歸，得回歸方程：Y=0.104 5 X+0.100 1，R2=0.999 6，結(jié)果顯示進(jìn)樣量在17.73～110.33 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.5 精密度考察 以44.13 μg/mL腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度考察。按“3.1”項下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果RSD為0.92%(n=6)，表明此條件下腺嘌呤具有良好的精密度。

圖7 腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品及哈蟆油樣品色譜圖

3.6 準(zhǔn)確度考察 稱取已知含量哈蟆油粉末6份，每份約0.1 g，取腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品適量，按“3.3”項下優(yōu)選出的方法進(jìn)行提取制備，哈蟆油標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液各進(jìn)樣10 μL，測得峰面積并計算含量，得平均回收率為97.84%，RSD=1.76%(n=6)。

3.7 穩(wěn)定性考察 稱取哈蟆油粉末約0.1 g，按“3.1”項下的方法提取制備，取供試液10 μL，分別在0、3、6、12、24 h對哈蟆油樣品進(jìn)樣分析，在24 h內(nèi)其峰面積分別為4.813 2、4.591 4、4.612 5、4.773 8、4.698 5，RSD=2.06%(n=5)，表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性考察 稱取哈蟆油粉約0.1 g，6份，按“3.1”項下的方法提取制備，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測定，測得哈蟆油腺嘌呤得率分別為464.38、458.62、469.77、472.18、466.46、460.39 μg/g，平均值為465.30 μg/g，RSD值為1.13%，說明該提取工藝穩(wěn)定。

4 結(jié)論

4.1 提取方法的選擇 試驗先對甲醇濃度、料液比、提取時間和提取濃度進(jìn)行單因素試驗，進(jìn)而以Design-Expert 8.0.6為分析軟件，進(jìn)行響應(yīng)面試驗，篩選出以73%甲醇溶液為提取溶劑，在61 ℃水浴條件下提取68 min，哈蟆油腺嘌呤最高得率為465.30 μg/g。

4.2 檢測方法的確定 HPLC檢測腺嘌呤濃度在17.73～110.33 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，且準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為哈蟆油腺嘌呤的檢測方法。

4.3 哈蟆油的藥用前景 哈蟆油是我國傳統(tǒng)的中藥，具有滋陰補(bǔ)腎的功效，現(xiàn)代藥理研究表明，其對體弱氣虛、病后失調(diào)、記憶力不佳、精力損耗、神經(jīng)衰弱、心悸失眠等具有較好的療效，是極具開發(fā)潛力的醫(yī)療、保健藥品。

本試驗以腺嘌呤為評價指標(biāo)，對哈蟆油腺嘌呤提取和檢測方法進(jìn)行初步探索，為哈蟆油質(zhì)量評價奠定一定基礎(chǔ)。

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Optimization of extraction technology for adenine from oviductus ranae by central composite design/response surface methodology

DING Jia-li1*,WEI Xing-xin2,REN Xiao-feng2

(1.Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou 310006,China;2.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

Objective To optimize the process of extracting adenine from oviductus ranae by central composite design/response surface methodology.Methods The analysis was achieved with an Inertsil ODS-SP Extend C18column (250 mm×4.6 mm,5.0 μm) by gradient elution of methanol and water at 25 ℃.The flow rate was 1.0 mL/min,injection volume was 10 μL,and detection wave length was set at 260 nm.The effects of influence factors such as methanol concentration,extraction time and extraction temperature on extraction rate of adenine was investigated using box-behnken design and response surface method.Results The results indicate that the calibration curves of adenine have good linearity over the range from 17.73 to 110.33 μg/mL with a regression equation of Y=0.104 5 X+0.100 1,R2=0.999 6.The mean recovery was 97.84% (RSD=1.76%,n=6).Optimum processing conditions were: the concentration of methanol 73%,the extraction time was 68 min,the extraction temperature was 61 ℃ as the rate of adenine was 465.30 μg/g.Conclusion Optimized processing technology is simple and stable.

Oviductus ranae;Adenine;Central composite design-response surface methodology;HPLC;Extraction technology

2014-11-26

1.浙江省中醫(yī)院,杭州 310006;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計劃(2013ZA027)

10.14053/j.cnki.ppcr.201508019

*通信作者