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胰腺癌特異相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA靶基因的篩選驗(yàn)證及分析**

徐勝前秦勇葉冠雄吳成軍王世潘德標(biāo)

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院麗水市人民醫(yī)院肝膽胰外科,浙江省麗水市323000

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(1ncRNA)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA，其本身不編碼蛋白，而是以多種形式調(diào)控基因的表達(dá)[1]；它不僅在表觀遺傳學(xué)修飾、轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、維持正常組織的發(fā)育和分化中發(fā)揮重要作用，而且通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期與凋亡影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移與侵襲，有望成為潛在的診斷標(biāo)志物與治療的靶點(diǎn)。Tahira[2]等通過(guò)cDNA轉(zhuǎn)錄組芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織篩選的335個(gè)lncRNA中,3個(gè)內(nèi)含lncRNA與胰腺癌轉(zhuǎn)移及凋亡密切相關(guān)，分別轉(zhuǎn)錄于MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1位點(diǎn)，并運(yùn)用熒光定量RT-PCR等技術(shù)證實(shí)這3個(gè)lncRNA為編碼蛋白基因。筆者通過(guò)熒光定量RT-PCR技術(shù)在60例胰腺癌及癌旁組織中篩選出表達(dá)量最高的胰腺癌特異相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA靶基因，為后續(xù)進(jìn)一步揭示胰腺癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制提供靶基因。

1資料與方法

1.1一般資料Trizol試劑、lncRNA提取試劑、熒光定量RT-PCR試劑盒、SYBR Green Ⅰ熒光染料購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。標(biāo)本收集：60例胰腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本，來(lái)源于2012年6月-2014年12月于我院行手術(shù)治療的患者，術(shù)前未行放療或化療，術(shù)后病理確診為胰腺癌的腫瘤組織(T)和癌旁正常組織(N)的液氮凍存標(biāo)本。標(biāo)本采集均經(jīng)過(guò)患者家屬同意并簽屬知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2總RNA的提取與RT-qPCR經(jīng)Trizol試劑(Invitrogen公司)抽提組織總RNA，焦磷酸二乙酯(DEPC)水復(fù)溶后，用核酸蛋白分析儀測(cè)定總RNA濃度，根據(jù)A260/A280比值和1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳RNA條帶完整性鑒定總RNA質(zhì)量。取2ng總RNA加入逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA溶液，加80μl DEPC稀釋后，置-20℃保存。用SYBR Green I PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)5μl cDNA溶液進(jìn)行熒光定量PCR，MAP3K14引物序列：上游為5’-ATTTGCTCCTGCTCCTCCAGA-3’，下游為5’-CCAGCCTCCTCCCAGTCTTTC-3’；PPP3CB引物序列:上游為5’-AAAGAGCTCTCTTCCCTCTTGCG-3’，下游為5’-CTGTGAATGTGGGAAGGTGCATTG-3’；DAPK1引物序列：上游為5’-GGTTCTCGCTCTTGTTGCGTG-3’，下游為5-TACTGACGGAA-ACACTGGCGG-3’；內(nèi)參照GAPDH引物序列：上游為 5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’，下游為 5’-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’；PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；然后95℃變性110s，60℃退火30s，70℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；解鏈曲線分析：95℃ 1min，55℃ 30s；然后緩慢升溫至95℃，升溫速率為0.2℃/s，最后得到擴(kuò)增曲線圖和解鏈曲線圖。本研究采用2-△△Ct法分析目的lncRNA的相對(duì)表達(dá)水平，以上具體操作依試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2結(jié)果

長(zhǎng)鏈非編碼RNA MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1 3種基因在胰腺癌及胰腺癌旁組織中均有表達(dá)，其基因的表達(dá)量詳見(jiàn)表1。三組基因在胰腺癌組織的基因表達(dá)量?jī)蓛杀容^有差異(P<0.01，F(xiàn)=32.37)，在胰腺癌旁組織的表達(dá)兩兩比較差異顯著(P<0.01，F(xiàn)=296.6)，三組基因在胰腺癌組織中的表達(dá)水平均低于在各自的胰腺癌旁組織的表達(dá)水平，其中DAPK1基因在胰腺癌及癌旁基因中表達(dá)量最高。

3討論

胰腺癌是世界上惡性程度及死亡率最高的常見(jiàn)腫瘤之一，由于其起病隱匿，臨床上缺乏有效的早期診斷手段及有效的治療方案[3，4]，盡管手術(shù)切除能夠起到一定程度的治療作用，但是胰腺癌患者的5年生存率仍然低于5%[5]，目前在這方面的臨床研究及腫瘤實(shí)驗(yàn)學(xué)有較大的進(jìn)步，但胰腺癌的預(yù)后仍然不盡如意[6];因此，尋找高特異性的早期分子標(biāo)志物，進(jìn)一步深入研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)于胰腺癌的早期診斷、治療意義重大。

表1　三組基因在胰腺癌及癌旁組織的

筆者利用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1 3組基因在60例胰腺癌及胰腺癌旁組織中均有表達(dá)(P<0.05)，且在胰腺癌組織的表達(dá)水平低于胰腺癌旁組織(P<0.05)；而Tahira等的研究也發(fā)現(xiàn)MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1 三組基因在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)腫瘤組織和非腫瘤組織中存在表達(dá)差異，這說(shuō)明筆者檢測(cè)的結(jié)果與Tahira等的研究一致；Tahira等發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)或轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生與胰腺組織中基因間區(qū)lncRNA的豐度有相關(guān)性，提示這類(lèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與胰腺癌的生物進(jìn)程、惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移有潛在的關(guān)系，而在筆者的檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)三組基因在胰腺癌組織及癌旁組織兩兩對(duì)比差異顯著(P<0.05)，其中DAPK1基因在胰腺癌組織及癌旁組織中表達(dá)水平最高，且在胰腺癌組織中表達(dá)低于癌旁組織，說(shuō)明DAPK1基因可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展、生物進(jìn)程、惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移有潛在的關(guān)系，是胰腺癌的一種可能的抑癌基因。

近年研究表明，lncRNA與人類(lèi)多個(gè)腫瘤發(fā)病關(guān)系密切，可在多個(gè)水平廣泛參與基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成，調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)[7,8]，然而，DAPK1是否在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要的角色，是否是胰腺癌高特異性的早期分子標(biāo)志物，仍有待深入探討。

參考文獻(xiàn)

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(編輯落落)

摘要目的：篩選并明確胰腺癌特異相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)差異，并對(duì)其進(jìn)行初步分析。方法：采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)篩選驗(yàn)證胰腺癌特異相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA MAP3K14、PPP3CB、DAPK1 3種靶基因在60例胰腺癌組織及配對(duì)癌旁組織表達(dá)差異最強(qiáng)的目標(biāo)lncRNA，為胰腺癌特異相關(guān)lncRNA的功能研究做鋪墊。結(jié)果：長(zhǎng)鏈非RNA MAP3K14,PPP3CB, DAPK1在各自的胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)水平均有意義(P=0.000，t=17.32；P=0.000，t=15.045；P=0.013，t=34.55)；在胰腺癌組織的表達(dá)量?jī)蓛杀容^有差異(P<0.01，F(xiàn)=32.37)，三組基因在胰腺癌旁組織的表達(dá)水平兩兩比較差異顯著(P<0.01，F(xiàn)=296.6)，其中DAPK1基因在胰腺癌及癌旁基因中表達(dá)量最高。結(jié)論：三種長(zhǎng)鏈非編碼RNA在胰腺癌及癌旁組織中明確表達(dá)，其中DAPK1基因表達(dá)量最高，說(shuō)明DAPK1與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且在胰腺癌組織中表達(dá)低于癌旁組織，說(shuō)明DAPK1是胰腺癌一種可能的抑癌基因。

關(guān)鍵詞胰腺癌長(zhǎng)鏈非編碼RNA篩選驗(yàn)證

Screening Verification and Analysis of Specific Long Non-coding RNA Relevant Target Genes of Pancreatic Cancer

XU Shengqian,QIN Yong,YE Guanxiong,etal.DepartmentofHepatobiliarySurgery,thePeopleHospitalofLishuiCity,ZhejiangProvince323000

ABSTRACTObjective:To screen and identify the differentially expressed of specific long non-coding RNA relevant target genes of pancreatic cancer between pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues,and analysis it preliminary.Methods:To screen the differentially expressed of specific long non-coding RNA MAP3K14,PPP3CB, DAPK1 of pancreatic cancer between pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues in 60 cases by RT-qPCR,which was prepared for the functional study of pancreatic cancer specific relevant lncRNA.Results:The expression levels of MAP3K14,PPP3CB, DAPK1 were significance between pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues respectively (P=0.000，t=17.32；P=0.000，t=15.045；P=0.013，t=34.55);the expression of three genes are different in pancreatic tissue,(P<0.01，F(xiàn)=32.37),the expression of three sets of gene in adjacent pancreatic tissue of pairwise comparisons were significant (P<0.01,F=296.6),which the expression of DAPK1 was highest in pancreatic cancer and paracancerous tissues.Conclusion:Three long non-coding RNAs in pancreatic cancer and adjacent pancreatic cancer tissue were expressed clearly, which DAPK1 expressed highest, this shows that DAPK1 was related to the occurrence and development of pancreatic cancer, and the expression level of DAPK1 in pancreatic cancer tissues was lower than that in the adjacent tissues, indicating that DAPK1 is a possible tumor suppressor genes of pancreatic cancer.

KEY WORDSPancreatic cancer，Long non-coding RNA，Microarray

收稿日期2015-04-27

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7585(2015)17-2288-03

基金項(xiàng)目：麗水市科學(xué)技術(shù)局公益性應(yīng)用技術(shù)項(xiàng)目(2012jyzb13)。通訊作者：秦勇