陳　慧，許妍姬

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室,吉林 延吉133000)

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阻斷淀粉樣前體蛋白-C端片段毒性通路對(duì)Cofilin磷酸化的影響

陳慧，許妍姬*

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室,吉林 延吉133000)

摘要：目的本研究欲探討阻斷淀粉樣前體蛋白-C端片段(Amyloid Precursor Protein C Terminal Fragments，APP-CTFs)毒性通路對(duì)Cofilin磷酸化的影響方法大鼠胚鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)，采取3種方法阻斷APP-CTFs毒性通路。①APP-695轉(zhuǎn)染后γ-內(nèi)切酶抑制劑DAPT處理②利用YENPTY段刪除的pEGFP-APP C99,C57轉(zhuǎn)染至大鼠神經(jīng)元細(xì)胞③GSK-3β抑制劑LiCl處理，3種方法阻斷后，均采用蛋白印跡方法檢測(cè)Ph-cofilin蛋白水平。結(jié)果DAPT處理組與未處理組比較Ph-cofilin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染YENPTY段刪除的pEGFP-APP CTFs組未能明顯增強(qiáng)磷酸化Cofilin的蛋白表達(dá)水平(P>0.05)，雖然轉(zhuǎn)染APP-CT99,57-pEGFP組與空載體對(duì)照組相比較，Ph-Cofilin蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。LiCl處理組與非處理組相比，Ph-Cofilin蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變(P>0.05)。結(jié)論提示APP-CTFs誘導(dǎo)的Cofilin磷酸化過(guò)程與APP-CTFs核轉(zhuǎn)移毒性通路有關(guān),但與其誘導(dǎo)的GSK-3β-Tau毒性通路無(wú)關(guān)。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1045)

到目前為止AD病的病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前仍缺乏特異的治療方法，因此世界各國(guó)醫(yī)藥界對(duì)AD的研究尤為重視，該領(lǐng)域已成為當(dāng)今世界研究的熱點(diǎn)[1]。研究AD的分子機(jī)制以尋找新的靶點(diǎn)是抗AD藥物開(kāi)發(fā)的集中所在。AD有各種發(fā)病假說(shuō)，如膽堿能功能低下假說(shuō)，炎癥或免疫假說(shuō)，基因突變假說(shuō)，淀粉樣蛋白假說(shuō)，氧化應(yīng)激及興奮性毒性假說(shuō)，凋亡假說(shuō)等。其中淀粉樣蛋白假說(shuō)一直很受重視。最近淀粉樣前體蛋白C端片段在發(fā)病機(jī)制里起重要作用的報(bào)道很多。淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)依次經(jīng)α-，β-，γ-分泌酶水解后形成不同長(zhǎng)度C端片段APP-CTFs，APP-CTFs的毒性機(jī)制貢獻(xiàn)于AD。其毒性機(jī)制是被各種酶切之后形成的AICD與Fe65結(jié)合進(jìn)行核轉(zhuǎn)移,后與CP2/LSF/LBP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合刺激GSK-3β基因，增強(qiáng)Tau磷酸化[2-5]。

AD腦組織除老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)之外，還包含Hirano bodies,是由肌動(dòng)蛋白和其結(jié)合蛋白cofilin構(gòu)成的節(jié)狀結(jié)構(gòu)[6-8]。老年性癡呆患者的腦皮質(zhì)和海馬回中發(fā)現(xiàn)的ADF/cofilin-肌動(dòng)蛋白節(jié)狀結(jié)構(gòu)，在正常人腦中沒(méi)有[9]。

我們?cè)谙惹暗难芯恐幸寻l(fā)現(xiàn)APP-CTF轉(zhuǎn)染可以使磷酸化-cofilin水平增高。此次我們想阻斷APP-CTFs毒性通路對(duì)Cofilin磷酸化的影響。采取3種方法阻斷APP-CTFs毒性通路。①APP-695轉(zhuǎn)染后γ-內(nèi)切酶抑制劑DAPT處理，阻斷APP-CTF的產(chǎn)生②利用YENPTY段刪除的pEGFP-APP C99,C57轉(zhuǎn)染，阻斷APP-CTF核內(nèi)毒性通路。③處理GSK-3β抑制劑LiCl，阻斷APP-CTF導(dǎo)致的Tau毒性通路。3種通路阻斷后，均采用蛋白印跡方法檢測(cè)Ph-cofilin蛋白水平。本研究在分子機(jī)制水平上更深層次地探討APP-CTFs對(duì)cofilin基因表達(dá)的影響，可為AD的發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)新的不同的毒性通路。

1材料與方法

1.1　材料

APP-CTFs[5]由韓國(guó)首爾醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教室徐維憲教授饋贈(zèng)。

1.1.1藥品與試劑胰蛋白酶(Sigma)；胎牛血清(Corning,N.Y,14831,USA)；DMEM培養(yǎng)液(Grand Island,N.Y,14072,USA)；Ph-cofilin和tubulin免疫染色抗體購(gòu)于德國(guó)默克密理博公司；10%DF培養(yǎng)液由本實(shí)驗(yàn)室自配；NDiff Neuro-2(N2)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑購(gòu)于德國(guó)默克密理博公司；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Grand Island,N.Y,14072,USA；Lipofectamine 2000從invitrogen公司購(gòu)買(mǎi)；辣根過(guò)氧化物山羊抗兔(抗屬)抗體，以及相應(yīng)WB封閉液、洗滌液、一抗二抗稀釋液均從碧云天生物科技公司購(gòu)買(mǎi)；胎牛血清；馬血清；SPF級(jí)SD大鼠由延邊大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器蛋白印跡電泳(轉(zhuǎn)膜)裝置、分析天平、生物顯微鏡、低高速容量離心機(jī)、恒溫水浴鍋、恒溫CO2培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、制冰機(jī)、移液器等均由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1質(zhì)粒的擴(kuò)增、提取和純化分別將含有重組質(zhì)粒pEGFP-N1-APLP2-CTFs(C57,C99)[5]和空載體pEGFP-N1的菌種用Kan+培養(yǎng)基培養(yǎng)并選取單菌落，取單菌落至10 ml含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、230 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，再轉(zhuǎn)入200 ml LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。按照質(zhì)粒大量提取試劑盒說(shuō)明提取、純化質(zhì)粒，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度。

1.2.2胚胎神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)選擇懷孕16-18天的大鼠將其用乙醚麻醉，解剖腹部取出胚胎放入預(yù)冷的D-hank’s液中。剪開(kāi)胚胎，取出仔鼠，用剪刀輕輕剪開(kāi)顱骨，剝離掉最上層的腦膜后，直接取大腦皮層組織(此過(guò)程在超凈臺(tái)操作)；將組織剪成約1 mm×1 mm塊狀并放置于新的D-hank’s液中離心；去上清液后的組織再加入0.25%的胰酶消化分解，于37 ℃水浴20 min。最后把消化過(guò)的組織用200目篩網(wǎng)進(jìn)一步碾碎過(guò)篩，得到神經(jīng)元細(xì)胞。

預(yù)先用含0.1%的多聚賴氨酸溶液包埋在蓋玻片上，促使神經(jīng)元細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。剛獲得的神經(jīng)元細(xì)胞用含5%的馬血清，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在5%濃度的CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第二天換成含有1%的N2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，第四天再更換含有5%的馬血清，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，5-7天進(jìn)行做后續(xù)處理。

1.2.3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組，①對(duì)照組轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體②APP-CTs轉(zhuǎn)染組③突變型APP-CTs轉(zhuǎn)染組

1.2.4Western印跡方法檢測(cè)ph-cofilin蛋白水平用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞，加入RIPA裂解液，在冰上用細(xì)胞刮裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞，4℃ 6 000 g rpm 離心5分鐘，得出細(xì)胞裂解液，蛋白定量，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液封閉1 h，用活化的ph-cofilin單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過(guò)夜， 洗滌液漂洗3次后加二抗辣根氧化酶(HRP)-IgG(1∶1000),室溫孵育1 h,洗膜三次后化學(xué)發(fā)光法顯色。用紫外分光光度計(jì)掃描條帶灰度值，β-actin作為內(nèi)參照，計(jì)算蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1DAPT處理對(duì)ph-cofilin蛋白表達(dá)的影響為了探究APP-CTFs的產(chǎn)生對(duì)Cofilin磷酸化的影響，我們轉(zhuǎn)染APP-695 整長(zhǎng)度(FL，F(xiàn)ulllength)cDNA后，處理DAPT。DAPT是γ-內(nèi)切酶的抑制劑，可以抑制APP-CTFs的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加入DAPT處理與非處理組相比較，磷酸化Cofilin的蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05，圖1)

2.2　轉(zhuǎn)染突變型APP-CTFs對(duì)ph-cofilin蛋白表達(dá)的影響

為了探究APP-CTFs誘導(dǎo)的Cofilin磷酸化過(guò)程是否與APP-CTFs的核轉(zhuǎn)移毒性通路有關(guān)。我們轉(zhuǎn)染了YENPTY段刪除的pEGFP-APPC99、C57轉(zhuǎn)染至大鼠神經(jīng)元細(xì)胞，觀察了磷酸化Cofilin的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果轉(zhuǎn)染YENPTY段刪除的pEGFP-APP CTFs組未能明顯增強(qiáng)磷酸化Cofilin的蛋白表達(dá)水平，與空載體對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異(P>0.05，圖2)。雖然轉(zhuǎn)染APP-CT99,57-pEGFP組與空載體對(duì)照組相比較，Ph-Cofilin蛋白表達(dá)水平明顯增加。(P<0.05，圖2)

圖1DAPT處理對(duì)磷酸化-cofilin蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染APP-695整長(zhǎng)度(FL,Full length)cDNA后，處理DAPT.DAPT是γ-內(nèi)切酶的抑制劑，可以抑制APP-CTFs的產(chǎn)生.每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自3次實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行了配對(duì)T-檢驗(yàn).

圖2轉(zhuǎn)染突變型APP-CTFs(#CT)對(duì)磷酸化-cofilin蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染YENPTY段刪除的pEGFP-APP C99、C57至大鼠胚鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞

2.3　LiCl處理對(duì)ph-cofilin蛋白表達(dá)的影響

為了探究APP-CTFs誘導(dǎo)的Cofilin磷酸化過(guò)程是否與APP-CTFs的GSK-3β-Tau毒性通路有關(guān)。我們選擇了GSK-3β抑制劑LiCl。轉(zhuǎn)染APP-CTFs基因片段后，處理10mM LiCl，結(jié)果LiCl處理組與非處理組相比，Ph-Cofilin蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。(P>0.05，圖3)

圖3LiCl處理對(duì)APP-CTFs誘導(dǎo)磷酸化-cofilin蛋白表達(dá)的影響大鼠胚鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)染APP-CTFs之前，預(yù)處理10 mM LiCl,LiCl是GSK-3β抑制劑.

3討論

老年性癡呆(阿爾茨海默病，Alzheimer disease,AD)患者病理典型變化是腦中老年斑(Senileplaque)和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)。淀粉樣前體蛋白(APP)先后經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶的剪切之后，產(chǎn)生了Aβ和不同長(zhǎng)度的APP-C端游離片段。最近，APP-CTFs在AD的發(fā)病機(jī)制里也起重要作用的報(bào)道很多[1-3]。淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)依次經(jīng)α-，β-，γ-分泌酶水解后形成不同長(zhǎng)度C端片段APP-CTFs，APP-CTFs的毒性機(jī)制貢獻(xiàn)于AD。其毒性機(jī)制是被各種酶切之后形成的AICD與Fe65結(jié)合進(jìn)行核轉(zhuǎn)移,后與CP2/LSF/LBP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合刺激GSK-3β基因，增強(qiáng)Tau磷酸化[2-5]

Cofilin是ADF蛋白家族成員，老年性癡呆與cofilin家族表達(dá)變化有關(guān)[10-12，18]。最近研究表明，異常的cofilin沉積可引起Tau神經(jīng)氈螺紋(neuropil threads),所以提示cofilin-肌動(dòng)蛋白束在AD病理機(jī)制中可能引起重要作用。但cofilin-肌動(dòng)蛋白節(jié)狀結(jié)構(gòu)形成的具體機(jī)制還未闡明[10-12]。Aβ誘導(dǎo)的退行性變化，通過(guò)LIM-激酶對(duì)ADF/cofilin-脫磷酸化來(lái)實(shí)行，闡明老年性癡呆神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良的潛在性機(jī)制[13]。

我們?cè)谙惹暗难芯恐幸寻l(fā)現(xiàn)APP-CTF轉(zhuǎn)染可以使磷酸化-cofilin水平增高。此次我們想阻斷APP-CTFs毒性通路對(duì)Cofilin磷酸化的影響。采取三種方法阻斷APP-CTFs毒性通路。首先，轉(zhuǎn)染APP-695 整長(zhǎng)度(FL，F(xiàn)ull length)cDNA 后，γ-內(nèi)切酶的抑制劑DAPT處理后觀察了對(duì)ph-cofilin蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果DAPT處理與非處理組相比較，磷酸化Cofilin的蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05，圖1)，說(shuō)明APP-CTFs的產(chǎn)生對(duì)Cofilin磷酸化過(guò)程是重要的環(huán)節(jié)。

其次，為了探究APP-CTFs誘導(dǎo)的Cofilin磷酸化過(guò)程是否與APP-CTFs的核轉(zhuǎn)移毒性通路有關(guān)。轉(zhuǎn)染YENPTY段刪除的pEGFP-APP CTFs組未能明顯增強(qiáng)磷酸化Cofilin的蛋白表達(dá)水平(P>0.05，圖2)，雖然轉(zhuǎn)染APP-CT99,57-pEGFP組與空載體對(duì)照組相比較，Ph-Cofilin蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05，圖2)。提示APP-CTFs誘導(dǎo)的Cofilin磷酸化過(guò)程與APP-CTFs的核轉(zhuǎn)移毒性通路有關(guān)。最近研究表明Cofilin蛋白有核進(jìn)入和輸出信號(hào)，況且這些信號(hào)作用于在應(yīng)激壓力狀態(tài)下可以形成適當(dāng)?shù)膔od 結(jié)構(gòu)[15]。其它的HD(Huntington disease,亨廷頓病性癡呆)疾病這些cofilin-肌動(dòng)蛋白節(jié)狀(actin rod)結(jié)構(gòu)被假設(shè)成有潛在的生理作用和假如被調(diào)控為結(jié)構(gòu)紊亂時(shí)可以增加患神經(jīng)變性性疾病的罹患率[16]。APP-CTFs和Cofilin核轉(zhuǎn)移和相互作用的進(jìn)一步分子生物學(xué)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

最后，為了探究APP-CTFs誘導(dǎo)的Cofilin磷酸化過(guò)程是否與APP-CTFs的GSK-3β-Tau毒性通路有關(guān)。我們選擇了GSK-3β抑制劑LiCl。結(jié)果LiCl處理組與非處理組相比，Ph-Cofilin蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。(P>0.05，圖3)提示APP-CTFs誘導(dǎo)的Cofilin磷酸化過(guò)程與APP-CTFs誘導(dǎo)的GSK-3β-Tau毒性通路無(wú)關(guān)。也有報(bào)道cofilin-肌動(dòng)蛋白節(jié)狀(actin rod)結(jié)構(gòu)的蓄積可以延伸tau病理變化[17]，況且這些變化與患者的年齡是無(wú)關(guān)的。APP-CTFs誘導(dǎo)的Cofilin磷酸化過(guò)程與Tau毒性通路之間的詳細(xì)的分子生物學(xué)機(jī)制也有待于再研究。

本研究在分子機(jī)制水平上更深層次地探討APP-CTFs對(duì)cofilin基因表達(dá)的影響，可為AD的發(fā)病機(jī)制提示一個(gè)新的不同的毒性通路，其具體更深的分子生物學(xué)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究探討。

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關(guān)鍵詞：APP- C端片段；Cofilin；DPAT,YENPTY,LICl

Effect of blocking toxicity pathways of C-terminal Fragment of Amyloid Precursor Protein on ADF/Cofilin in rat primary neuronal culture cellsCHENHui,XUYan-ji.(DepartmentofPreventiveMedicine,MedicalCollegeYanbianUniversity,Yanji,Jilin133000,China)

Abstract:ObjectiveIn this study,we aim to eluciate the effects of blocking toxicity pathways of APP-CTFs on cofilin phosphorylationMethodsrat primary neuronal cells were cultured and choosed three different blocking toxicity pathways of APP-CTFs.①transfected with APP-695 Full length cDNA,and treated with an inhibitor of γ-secretase,DAPT②transfected with deletion of YENPTY domain of APP-CTFs.③treated with an inhibitor of GSK-3β,LiCl.ResultsAs an inhibitor of γ-secretase,DAPT treatment decreased the phospho-cofilin (Ph-cofilin) protein levels in the transfected group with a full length of APP-695.When transfected with the deletion of the YENPTY domain of mutated APP-CTFs,Ph-cofilin did not have any significant increase.As an inhibitor of GSK-3β,LiCl treatment did not block the APP-CTFs that induced cofilin phosphorylation.ConclusionIndicating that this may be related to the translocation of the nucleus pathway; but not mediated by the GSK-3β pathway.

Key words:APP；cofilin; C-terminal Fragment; DPAT;YENPTY;LICl

(收稿日期：2015-03-15)

作者簡(jiǎn)介：許妍姬(1973-),女,朝鮮族，博士，副教授,主要從事神經(jīng)毒理學(xué)研究。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ93

文章編號(hào)：1007-4287(2015)07-1045-05

*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81160159)