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大鼠心肌缺血心肌酶學(xué)、心肌超微結(jié)構(gòu)的變化及淫羊藿苷的影響

呂銘洋1，姜微2，崔新明3，敬海峰3，柳明洙1*

(1.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉133000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 超聲科，吉林 長春130033;

4.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021)

淫羊藿苷( icariin,ICA)是從小檗科植物淫羊藿(Epimedium grandiflorum)莖葉中提取出來的一種8-異戊烯基黃酮醇苷類化合物。淫羊藿具有溫陽補(bǔ)腎、強(qiáng)筋鍵骨、祛風(fēng)除濕等功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,淫羊藿苷能有效對抗異丙腎上腺素致大鼠急性心肌缺血[2]，可以降低大鼠血清中炎癥因子 IL-1β 及心肌組織 TNF-α 的生成和釋放，降低心肌組織 MPO 活性和 NF-κB 表達(dá)，改善心肌組織的病理變化[3]。本文采用結(jié)扎左冠狀動脈造成大鼠心肌缺血模型，觀察淫羊藿苷在大鼠心肌缺血模型中心功能、電鏡及心肌酶學(xué)的變化。探討淫羊藿苷對缺血心肌的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1動物Wistar大鼠，體重210-245 g，雄性，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物室。合格證號：SCXK-(吉)2013-0001。

1.1.2藥品淫羊藿苷(由吉林大學(xué)藥學(xué)院組合化學(xué)與創(chuàng)新藥物研究中心提供,含量95%以上,用溶媒溶解后配置成所需濃度);阿托伐他汀鈣片由輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號：H98099。LDH、CK、AST測定試劑盒由中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號分別為140501、130851、141151。SOD、MDA測定試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號分別為20140918、 20140920。戊巴比妥鈉由北京化學(xué)試劑公司提供，批號：060222。TTC由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號：T8877。無水乙醇由北京化工廠提供，批號：20130822。氯化鈉注射液由四平巨能藥業(yè)有限公司提供，批號：140118。乙醚由天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司提供，批號：20140504。

1.1.3儀器 EOS880型半自動血液生化分析儀由意大利生產(chǎn)；電子秤為沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)(LD25-2)由北京離心機(jī)廠生產(chǎn)；UV755B紫外可見分光光度計(jì)為上海分析儀器廠提供；SSW型電熱恒溫水槽由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。BI-2000圖像分析系統(tǒng)由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)。PowerLab生理信號實(shí)時記錄系統(tǒng)由澳大利亞生產(chǎn)。

1.2　方法

淫羊藿苷5.0、10.0、20.0 mg·kg-1各劑量組、阿托伐他汀鈣片10.0 mg·kg-1組于手術(shù)前一周腹腔注射給藥，假手術(shù)組、模型組給予等容積的生理鹽水，每天腹腔注射給藥一次，給藥第7天，給藥1 h后大鼠在乙醚麻醉下仰位固定于手術(shù)臺上，連接PowerLab生理信號實(shí)時記錄系統(tǒng)記錄正常心電。胸部去毛，應(yīng)用75 %酒精消毒皮膚，胸部正中縱向切開皮膚約2 cm，于 3-4 肋間心臟搏動最明顯處，用止血鉗鈍性分離肌層，打開胸腔，拉鉤擴(kuò)胸，打開心包膜，暴露心臟，于肺動脈圓錐及左心房交界處結(jié)扎冠狀動脈左前降支，將心臟送回胸腔，并擠出胸腔內(nèi)血液和氣體，迅速關(guān)閉胸腔。記錄心肌缺血即刻標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，觀測ST段偏移幅度，以ST段抬高0.2 mV定為造模成功。缺血24 h候后以戊巴比妥納30.0 mg·kg-1腹腔注射麻醉，記錄大鼠心肌缺血24 h心電。每組動物腹主動脈取血，處死大鼠，剪下心臟，用生理鹽水洗凈，剪掉右心室，將心臟順房室溝從心尖到心基部平行均勻的將心室切成5片(厚度在0.1 cm左右)。將心肌切片放置于1% TTC(pH 7.4)染液中，在37℃恒溫水浴中染色3-5 min。通過醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)將各組心肌切片以圖片形式攝入電腦，經(jīng)軟件系統(tǒng)計(jì)算心肌梗死面積和左心室面積，通過公式(心肌梗死面積百分比=未染色心肌面積和/心肌切片總面積和×100%)計(jì)算出心肌梗死面積占心肌總面積的百分比。離心，取血清。用EOS880型半自動生化分析儀檢測血清AST、CPK、LDH水平。按照試劑盒方法測定血清SOD的活性及MDA含量的變化。取1 mm×1 mm×2 mm大小梗死區(qū)心肌組織,經(jīng)4%戊二醛前固定,1%鋨酸后固定,乙醇系列脫水,Epon812包埋,型超薄切片機(jī)半薄切片定位后,超薄切片(70 nm),雙重電子染色。薄切片,醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色后,在電子顯微鏡下進(jìn)行心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。

2結(jié)果

2.1　淫羊藿苷對心肌缺血大鼠ECGS-T段和MIS的影響

與假手術(shù)組相比較，模型組梗死面積明顯升高(P<0.001)，說明模型成立。淫羊藿苷5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg劑量組及阿托伐他汀鈣片組可明顯降低心肌梗死面積(P<0.05，P<0.01)。與假手術(shù)組相比較，模型組S-T段明顯升高(P<0.001)，說明模型成立。淫羊藿苷5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg劑量組及阿托伐他汀鈣片組可明顯降低S-T段(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果詳見表1。

2.2　淫羊藿苷對心肌缺血大鼠血清AST，CK及LDH的影響

與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠血清AST、CK、LDH水平均明顯升高(P<0.01、P<0.001)，說明模型成立。淫羊藿苷5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg劑量組及阿托伐他汀鈣片組可明顯降低血清AST的含量(P<0.05)，淫羊藿苷5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg劑量組及阿托伐他汀鈣片組可明顯降低血清CK的含量(P<0.05、P<0.01)，其他各組無明顯作用；淫羊藿苷5.0mg/kg、 10.0mg/kg、20.0mg/kg劑量組及阿托伐他汀鈣片組可明顯降低血清LDH的含量(P<0.05、P<0.01)，結(jié)果見表2。

表1　　心肌缺血大鼠ECGS-T段和心肌梗死面積的

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；與假手術(shù)組比較，▲▲▲P<0.001

組別劑量(mg·kg-1)AST(UI/L)CK(UI/L)LDH(UI/L)假手術(shù)組———132.07±28.87310.69±81.34419.72±99.07模型組———325.34±109.39▲▲▲732.95±158.31▲▲▲980.78±321.49▲▲阿托伐他汀鈣片10.0230.89±49.29*596.44±155.12*601.73±256.71*淫羊藿苷5.0241.59±80.61*585.34±95.39*708.10±237.60*10.0192.14±57.05**471.64±203.78**521.92±154.09**20.0218.34±44.29*563.73±180.03*621.55±183.42*

注：與模型組比較，*P<0.05 ,**P<0.01 與假手術(shù)組比較，▲▲P<0.01 ，▲▲▲P<0.001

2.3　淫羊藿苷對心肌缺血大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px的影響

與假手術(shù)組相比較，模型組血清MDA水平均明顯升高(P<0.001)，SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)，說明模型成立。淫羊藿苷5.0 mg/kg、10.0 mg/kg、20.0 mg/kg劑量組及阿托伐他汀鈣片組可明顯降低血清MDA的含量(P<0.05，P<0.01)，各劑量組及阿托伐他汀鈣片可明顯升高血清SOD及GSH-Px的含量(P<0.05，P<0.01、P<0.001)，結(jié)果見表3。

組別劑量(mg·kg-1)MDA(nmol/L)SOD(U/mL)GSH-Px(U/mL)假手術(shù)組———5.27±0.87180.69±11.5231.88±8.17模型組———9.77±2.83▲▲▲143.44±16.73▲▲▲19.64±5.57▲▲阿托伐他汀鈣片10.07.44±2.27*159.64±17.85*26.49±5.10*淫羊藿苷5.06.91±1.83*164.94±9.75*25.92±3.93*10.05.90±1.37**170.03±9.96***27.16±3.64*20.07.52±2.40*165.99±8.94**26.52±2.49**

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與假手術(shù)組比較，▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001

2.4　淫羊藿苷對急性心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

假手術(shù)組：心肌線粒體包膜完整，嵴排列整體、連續(xù)，肌絲結(jié)構(gòu)排列清晰，肌膜排列完整，細(xì)胞核清晰可見。模型組：肌絲排列疏松、斷裂、紊亂，明暗帶模糊不清，線粒體排列紊亂，有空化，核周圍細(xì)胞質(zhì)空化，肌膜破損，細(xì)胞膜消失。呈凝聚狀。阿托伐他汀鈣片組：心肌線粒體沿肌絲長軸排列尚規(guī)整，線粒體嵴無明顯破壞，心肌細(xì)胞肌絲排列規(guī)整，無明顯破壞。

淫羊藿苷5.0 mg·kg-1組：肌絲排列比較整齊，各帶較清晰，可見少量肌絲斷裂，線粒體仍有嵴斷裂，呈凝聚狀。淫羊藿苷10.0 mg·kg-1組：肌絲排列比較整齊，各帶清晰，可見少量肌絲斷裂，線粒體嵴呈凝聚狀。淫羊藿苷20.0 mg·kg-1組：肌膜完整，細(xì)胞核清晰，心肌細(xì)胞肌絲排列整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰可見，線粒體嵴比較清晰。見圖1。

圖1　淫羊藿苷對心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞超

3討論

心電圖ST段的變化是心肌缺血最早期出現(xiàn)的、最敏感和確切的指標(biāo)之一，能夠反映心臟的損傷程度。模型組血清 LDH、CK、AST釋放增多，心肌梗死范圍增大，與電鏡下超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)模型組肌膜破損、細(xì)胞膜消失、肌絲斷裂、線粒體增生腫脹、溶酶體膜破裂、有明顯的空泡變性相吻合。通過TTC染色,可將非缺血區(qū)染成紅色，而缺血區(qū)不染色，故可直觀的評判心肌缺血程度[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，淫羊藿苷可降低大鼠冠脈結(jié)扎所致心肌缺血ST段的抬高，減少心肌細(xì)胞中LDH、AST和CK的釋放和心肌梗死面積。

心肌缺血時有大量自由基生成，使心肌細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，會加重心肌缺血，增加心肌細(xì)胞的凋亡和心肌組織的壞死[5]。 MDA 是評價心肌缺血損傷的較好指標(biāo)之一。 SOD 和 GSH-Px 是能夠清除氧自由基的酶，所以SOD 和 GSH-Px 活性的高低可間接反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)中阿托伐他汀鈣片組、淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組血清中MDA 含量明顯低于模型組，SOD和GSH-Px 的活性明顯高于模型組，具體作用就是通過提高 SOD 的活力來對抗氧自由基。

有研究表明，心肌線粒體是細(xì)胞清除氧自由基、進(jìn)行呼吸作用和能量轉(zhuǎn)換的重要場所，是對心肌缺血異常敏感的細(xì)胞器，其提供的能量是細(xì)胞生命活動的保證，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性是反映心肌損傷的敏感性指標(biāo)[6]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與模型組相比，電鏡觀察顯示淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，心肌細(xì)胞肌絲排列規(guī)則，肌絲明暗帶清楚，線粒體腫脹，嵴部分?jǐn)嗔?，有空泡，核膜較清晰。表明淫羊藿苷能夠保護(hù)缺血引起的細(xì)胞損傷。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典( 一部) [M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:306- 308．

[2]潘志偉，王秋娟，楊涓，等.淫羊藿苷對異丙腎上腺素致大鼠急性心肌缺血的影響[J]．中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(5):622.

[3]郭慶軍，王桂敏，張秀秀.淫羊藿苷預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的影響[J]．中國病理生理雜志，2013,29(11):2034.

[4]周玖瑤，林輝，李銳.環(huán)維黃楊星D對心肌缺血大鼠LDH、NO、NOS及iNOS水平的影響[J]．中藥材，2006，29(12):1337.

[5] Murphy E，Steenbergen C.Mechanism underluing acutrprotection from cardiac ischemia-reperfusion injury[J]．Physiol Rev，2008，88:581．

[6]王小燕，景桂霞.黃芪預(yù)處理對家兔心肌缺血再灌注后心肌線粒體結(jié)構(gòu)及功能的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,29(3):329.

(收稿日期：2014-06-25)

文章編號：1007-4287(2015)07-1057-03

*通訊作者