沈繼春,李　陽,劉曉梅,張愛民,劉冀琴

(中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 1.血液科;2.骨科;3.檢驗(yàn)科,天津300162)

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多發(fā)性骨髓瘤患者miR-21和miR-32的表達(dá)及臨床應(yīng)用

沈繼春1,李陽2,劉曉梅3,張愛民3,劉冀琴3

(中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 1.血液科;2.骨科;3.檢驗(yàn)科,天津300162)

摘要：目的探討microRNA-21( miR-21) 和microRNA-32( miR-32)在多發(fā)性骨髓瘤( MM) 骨髓單個核細(xì)胞中的表達(dá)水平及意義。方法選取2010年1月至2014年1月在我院血液科及骨科就診的多發(fā)性骨髓瘤患者46 例和正常對照的骨髓標(biāo)本30例作為研究對象，患者均符合多發(fā)性骨髓瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)，采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測骨髓單個核細(xì)胞中miR-21和miR-32的表達(dá)水平。結(jié)果miR-21和miR-32 在MM 中的表達(dá)水平明顯高于正常對照組，難治組miR-21和miR-32 表達(dá)水平明顯高于初治組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。治療緩解組miR-21和mR-32 的表達(dá)水平低于初治組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論miR-21和miR-32 的表達(dá)可以對MM患者疾病進(jìn)展和預(yù)后進(jìn)行預(yù)測。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1123)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)為一種發(fā)病率較高的血液系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病，其最主要病理特征是骨髓中出現(xiàn)能夠無限增殖的異常的漿細(xì)胞[1]，并進(jìn)一步導(dǎo)致相關(guān)組織和器官損傷。其在血液系統(tǒng)腫瘤中約占10%-15%，位居第二位[2]。對于多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制很多是針對編碼蛋白的基因開展的研究，近年來，學(xué)者對于非編碼微小RNA(microRNA，miRNA)的研究逐漸增多，這對于研究多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制，提高該病的治療效果，進(jìn)行疾病的預(yù)后研究都具有一定的意義。本研究采用熒光定量RT-PCR方法檢測miR-2l和miR-32在多發(fā)性骨髓瘤患者和對照組患者的骨髓液中的表達(dá)量，以便進(jìn)一步研究miRNA在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病中的作用和意義。

1資料與方法

1.1　研究對象

選取2010年1月至2014年1月在我院血液科和骨科確診的老年多發(fā)性骨髓瘤患者46名作為研究對象，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第三版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于多發(fā)性骨髓瘤的判定指標(biāo)[3]進(jìn)行，排除標(biāo)準(zhǔn)為：近期患有嚴(yán)重感染性疾病患者、伴有自身免疫性疾病、嚴(yán)重的臟器功能障礙者、以及同時患有其他惡性腫瘤者。病例組共46例，其中男性 28 例，女性18例，年齡35-81 歲，平均(58.9±10.4) 歲，按照EMBT 標(biāo)準(zhǔn)對患者的緩解情況分組，其中初治組16例(16/46，34.8%)，緩解組13例(13/46，28.2%)，難治組17例(17/46，37.0%)；按照臨床D-S分期標(biāo)準(zhǔn)對MM患者進(jìn)行分組：Ⅰ期4例(4/46，8.7%)，Ⅱ期17例(17/46，37.0%)，Ⅲ期25例(25/46，54.3%)；對照組選擇骨髓像正常的門診其他疾病患者30例，男性 18 例，女性12例，年齡37-78 歲，平均( 57.8±9.8) 歲。

1.2　儀器與試劑

北京市六一儀器廠DYZ-22A型電泳儀、美國ABI公司 IMMAGE 免疫化學(xué)分析儀、德國 Heraeus 公司的7600-110 自動生化分析儀、美國Implen公司的核酸與蛋白紫外檢測儀、美國ABI公司的ABI7300 實(shí)時熒光PCR儀，德國Sigma公司的低溫高速離心機(jī)，Invitrogen 公司的TRIzol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，引物合成由上海生工生物公司完成。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

①抽取骨髓液5 ml，使用生理鹽水稀釋至4倍，緩慢加到4 ml的分離液中離心，得到單個核細(xì)胞，以生理鹽水洗滌3次，接種于15%牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，放置于5%二氧化碳、37℃恒溫、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②按照TRIzol試劑說明書要求抽提總RNA，檢測RNA溶液吸光度值定量,A260 nm/ A280 nm>1.8時可以進(jìn)行檢測。③加poly(A)尾后，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，以dT為引物進(jìn)行反應(yīng)，以U6為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR法進(jìn)行擴(kuò)增,所有樣品做3個復(fù)孔。分別進(jìn)行miR-21和miR-32表達(dá)量的檢測。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得資料采用excel建立數(shù)據(jù)庫，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)值變量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，兩組間的均數(shù)比較使用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的比較使用方差分析，組間比較使用q檢驗(yàn)，分類變量資料使用相對數(shù)指標(biāo)進(jìn)行描述，組間比較使用χ2檢驗(yàn)，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　各組患者的一般情況比較

本次研究共選擇病例組46例和對照組患者30例，兩組患者年齡和性別分布均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05)(表1)。

表1　病例組和對照組患者的基線情況比較

2.2　各組患者miR-21的表達(dá)水平比較

本次研究共46例多發(fā)性骨髓瘤患者和30例對照,各組患者miR-21的表達(dá)水平如表2所示，4組患者的miR-21的表達(dá)有差異，4組的表達(dá)水平不完全相等(P<0.001)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)初治組和難治組的表達(dá)均高于對照組(q=9.903P<0.05；q=15.607，P<0.05)，初治組的表達(dá)水平也高于緩解組(q=7.937，P<0.05)，緩解組的表達(dá)水平低于難治組(q=12.584，P<0.05)，緩解組和對照組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2　各組患者miR-21的表達(dá)水平比較

#3組之間兩兩比較均P<0.05，*與對照組比較P<0.05

2.3　各組患者miR-32的表達(dá)水平比較

各組患者miR-32的表達(dá)水平如表3所示，4組患者的miR-32的表達(dá)有差異(P<0.001)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)初治組和難治組的表達(dá)均高于對照組(q=29.037P<0.05；q=36.950，P<0.05)，初治組的表達(dá)水平也高于緩解組(q=22.325，P<0.05)，緩解組的表達(dá)水平低于難治組(q=28.673，P<0.05)，緩解組和對照組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3　各組患者miR-32的表達(dá)水平比較

#3組之間兩兩比較均P<0.05，*與對照組比較P<0.05

2.4　不同期別MM患者miR-21和miR-32的表達(dá)水平

不同期別MM患者miR-21和miR-32的表達(dá)水平如表4所示，不同期別的患者miR-21和miR-32水平均有差異(F=79.02，P<0.001；F=93.16，P<0.001)，miR-21的表達(dá)水平在Ⅰ期和Ⅱ期患者的之間有差異(q=3.614，P<0.05)，Ⅰ期和Ⅲ期患者比較有差異(q=12.587，P<0.05)，Ⅱ期和Ⅲ期患者比較有差異(q=15.174，P<0.05)；miR-32的表達(dá)水平在Ⅰ期和Ⅲ期患者的之間有差異(q=11.421，P<0.05)，Ⅱ期和Ⅲ期患者比較有差異(q=17.821，P<0.05)；Ⅰ期和Ⅱ期患者比較不能認(rèn)為有差異(q=0.987，P>0.05)。MM患者miR-21和miR-32的表達(dá)水平均是隨著期別的進(jìn)展，表達(dá)水平提高。

表4　不同期別MM患者miR-21和miR-32的表達(dá)水平

◇3組之間兩兩比較均P<0.05，與Ⅱ期比較△P<0.05，與Ⅰ期比較☆P<0.05

3討論

多發(fā)性骨髓瘤是造血系統(tǒng)的常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高且預(yù)后差、發(fā)病隨年齡增長而增高。由于漿細(xì)胞廣泛的過度增殖和浸潤，并分泌大量免疫球蛋白，導(dǎo)致嚴(yán)重的體液免疫缺陷，進(jìn)而引起貧血、反復(fù)感染難以控制、廣泛骨質(zhì)破壞、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀以及難以逆轉(zhuǎn)的腎臟損害等一系列臨床表現(xiàn)，這些都會使得疾病的預(yù)后不良。近年來人口老齡化的加劇等多方面的原因影響，使多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢，但對該病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展取得的成果還較少，主要集中在遺傳學(xué)改變和細(xì)胞因子的作用[4]。目前，多發(fā)性骨髓瘤的治療效果個體差異較大，已知的預(yù)后評價指標(biāo)不能很好地體現(xiàn)病情的復(fù)雜性，故對疾病發(fā)病機(jī)制和影響預(yù)后的因素的進(jìn)一步研究可以很好的指導(dǎo)臨床的治療工作。關(guān)于微小RNA(miRNA)在該病發(fā)病機(jī)制中所起的作用的研究為進(jìn)一步探索該病的發(fā)病機(jī)制提出了新方向。miRNA可以對腫瘤細(xì)胞的促進(jìn)凋亡和抑制凋亡起到作用。這讓我們對于多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識進(jìn)一步得到提高。

有文獻(xiàn)報道[5]，miR-32表達(dá)水平的升高在包括多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)病中發(fā)揮著重要的致癌基因的作用，miR-32的水平升高使受損的細(xì)胞能夠繼續(xù)存活，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展；也有研究發(fā)現(xiàn)[6]，miR-32表達(dá)水平的升高以PCAF為靶向基因，PCAF可以起到正向調(diào)節(jié)抑癌基因p53的作用，所以miR-32的高表達(dá)會導(dǎo)致p53的表達(dá)降低，故其可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展；也有學(xué)者認(rèn)為[7]，miR-32的作用是以凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bim為靶分子的，而Bim在造血細(xì)胞自身免疫缺陷和腫瘤的形成過程中起著重要的作用，所以miR-32表達(dá)的升高會使得Bim的表達(dá)降低，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。以上研究結(jié)果證實(shí)了miR-32在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病過程中具有重要作用，但還缺乏miR-32的表達(dá)水平在多發(fā)性骨髓瘤患者治療過程中變化。目前關(guān)于miR-21的研究很多，發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)升高[8]。miR-21的過表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤和白血病等腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。miR-21可以調(diào)節(jié)SPRY2的表達(dá)，而SPRY2基因在部分腫瘤中的表達(dá)水平下降，可以使腫瘤細(xì)胞MAPK/ERK信號過度活化，故SPRY2被認(rèn)為是抑制MAPK/ERK信號的癌基因。相關(guān)研究顯示，miR-21下調(diào)SPRY2基因的表達(dá)水平在體外環(huán)境下能促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移功能，但相關(guān)體內(nèi)試驗(yàn)有待進(jìn)一步研究，腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力是影響腫瘤惡性程度和預(yù)后的重要因素。所以在分子水平研究多發(fā)性骨髓瘤的增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制、判斷疾病的預(yù)后對該病的治療是非常重要的。

本次研究發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者的miR-21和miR-32的表達(dá)水平均高于正常對照組，這和其他研究結(jié)果是一致的[9]。而經(jīng)化療治療后，治療緩解組MM 患者miR-21和miR-32的表達(dá)均有所降低，而難治組的miR-21和miR-32表達(dá)明顯高于初治組患者，這些結(jié)果提示，miR-21和miR-32與多發(fā)性骨髓瘤患者的發(fā)病有關(guān)，其可能在發(fā)病的過程中起到重要的致癌基因的作用。而緩解組的表達(dá)水平低于難治組則可說明miR-21的表達(dá)水平可以反應(yīng)疾病的預(yù)后，高表達(dá)的患者對于化療的效果相對較差，緩解組和對照組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示有效的治療使miR-21的水平向正常水平變化。所以miR-21和miR-32的高表達(dá)可能預(yù)示著疾病的預(yù)后不良，miR-21和miR-32可作為多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后判斷指標(biāo)使用。本次研究結(jié)果同時顯示，不同期別的MM患者miR-21和miR-32水平均隨著腫瘤期別的發(fā)展而升高，這也說明miR-21和miR-32和腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，可以作為預(yù)后判斷的參考。

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[9]M Eugelhardt，M Kleber，J Udi.Current approaches in multiple myeloma and other cancer-related bone diseases[J].Deutsche mediziuische Wocheuschrift，2012，137 (20)：1057.

關(guān)鍵詞：多發(fā)性骨髓瘤；miR-21；miR-32

Expression and Clinical value of microRNA-21 and microRNA-32 in multiple myeloma patientsSHENJi-chun,LIYang,LIUXiao-mei,etal.(AffiliatedHospitalofLogisticalCollegeofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of micro RNA-21( miR-21) and RNA-32( miR-32) in multiple myeloma( MM) patients，and the relationship of its expression with clinical features．MethodsTo collect patients admitted to our hospital’s hematologic and orthopedic department from January 2010 to January 2014,total 46 MM patients and 30 normal controls.The expression levels of miR-21 and miR-32 in bone marrow mono-nuclear cells of MM patients and normal controls were examined by real-time polymerase chain reaction．ResultsThe expression of miR-21 and miR-32 in MM patients were obviously higher than that in normal control with statistical differences(P<0.05)．The expression of miR-21 and miR-32 in refractory MM patients were obviously higher than that in in normal control with statistical significance(P<0.05)．ConclusionExpression of miR-21 and miR-32 in MM plays an important role in the development and progression of MM，and is possible to become a predictor of disease progression and efficacy in MM．

Key words:multiple myeloma ；miR-21；miR-32

(收稿日期：2014-07-04)

作者簡介：沈繼春(1968-)，女，碩士研究生，副主任醫(yī)師，副教授,從事貧血及造血系統(tǒng)惡性疾病的診斷及治療的臨床工作。

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R739.42

文章編號：1007-4287(2015)07-1123-04