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Fibulin-5在盆腔器官脫垂患者主韌帶組織中的表達(dá)及意義**

程曉燕吳紅蓮呂偉超朱衛(wèi)中鄭紅楓

浙江省麗水市人民醫(yī)院婦科323000

盆腔臟器脫垂是婦科的常見(jiàn)病，多發(fā)于中老年婦女，雖然其對(duì)患者的生命無(wú)威脅，但是嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。盆腔臟器脫垂的主要治療方法為手術(shù)治療，是絕經(jīng)后婦女行婦科手術(shù)的常見(jiàn)原因[1]。但該類(lèi)手術(shù)復(fù)發(fā)率較高，近30%患者因術(shù)后復(fù)發(fā)需再行手術(shù)。關(guān)于盆腔臟器脫垂的相關(guān)研究幾十年，至今其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，考慮為多因素的作用。其中盆底支持組織中結(jié)締組織與其密切相關(guān)，結(jié)締組織的彈性、韌性以及相關(guān)功能均影響著盆腔臟器脫垂的發(fā)生。彈性纖維的缺失促進(jìn)了結(jié)締組織的老化。彈性蛋白是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，一般是以彈性蛋白原的形式分泌至細(xì)胞外，通過(guò)彼此交聯(lián)進(jìn)而形成彈性纖維[2]。在彈性蛋白聚合過(guò)程中, Fibulin-5作為彈性蛋白交聯(lián)排列的支架使LOXL-1集中在纖維集合位點(diǎn)從而生成彈性蛋白共價(jià)交聯(lián)。本文通過(guò)測(cè)定盆腔器官脫垂患者主韌帶組織中Fibulin-5的表達(dá)情況，探討Fibulin-5與其發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，具體如下。

1臨床資料

選擇2012年12月-2014年12月我院絕經(jīng)后因盆腔器官脫垂需行全子宮切除患者50例為實(shí)驗(yàn)組，選擇同期絕經(jīng)后無(wú)盆腔器官脫垂因其他婦科疾病(如子宮良性腫瘤或子宮頸上皮內(nèi)瘤變等婦科疾病)需行全子宮切除患者50例為對(duì)照組。分別于術(shù)中取子宮主韌帶長(zhǎng)度約0.5cm。

2研究方法

2.1實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Fibulin-5 mRNA

2.1.1標(biāo)本準(zhǔn)備：所有組織均在行全子宮切除術(shù)中留取,取距宮頸0.5cm處子宮骶韌帶,長(zhǎng)度約0.5cm,離體30min內(nèi)無(wú)菌條件下立即至于-80℃冰箱或液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄：取上述備用主韌帶組織，研磨成漿狀，加入1ml Trizol勻漿，于室溫下放置5min。將漿狀組織移至EP管中，加入氯仿并離心，將EP管中上層水相移至新的EP管中。后加入0.5ml異丙醇，室溫沉淀離心,棄上清。加乙醇1ml洗滌RNA。所得RNA溶于DEPC水中,取5μl經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA的完整性。其余RNA于-20℃保存。

25μl反轉(zhuǎn)錄體系中包括總RNA 4μg(約2μl),M-MLV(美國(guó)Promega公司) 1μl,5X緩沖液5μl,dNTP 2μl,RNasin 0.5μl,隨機(jī)引物1μl,25mmol/L MgCl24μl及DEPC水。反轉(zhuǎn)錄條件:42℃ 60min,95℃ 5min,冰浴5min,此反應(yīng)產(chǎn)物即為反轉(zhuǎn)錄的cDNA,置-20℃保存。

2.1.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Fibulin-5 mRNA水平：采用RT-PCR法檢測(cè)Fibulin-5的表達(dá)。采用逆轉(zhuǎn)錄酶和通用引物oligo(dT)15，以RNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一鏈。再以cDNA為模板，用內(nèi)標(biāo)引物與目標(biāo)引物進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：50℃ 180s、95℃ 300s，然后95℃15s、60℃ 45s，共40個(gè)循環(huán)。計(jì)算HEC1的表達(dá)量=2-ΔCt×100%，ΔCt= Ct目標(biāo)基因值-CtGAPDH[3]。引物序列見(jiàn)表1。

表1　基因的引物和探針序列

2.2ELISA檢測(cè)Fibulin-5的表達(dá)取上述備用主韌帶組織，研磨成漿狀，于室溫下放置5min,將漿狀組織移至EP管中離心，去上清液備用。采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法檢測(cè)所有受檢者Fibulin-5水平，試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，按照Fibulin-5試劑盒說(shuō)明書(shū)中操作流程進(jìn)行操作。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1兩組子宮主韌帶中Fibulin-5 mRNA表達(dá)水平比較經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示觀察組患者的主韌帶組織中Fibulin-5 mRNA的表達(dá)為0.36±0.12，對(duì)照組為0.92±0.34，觀察組Fibulin-5的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)。

3.2兩組患者Fibulin-5蛋白表達(dá)水平比較Fibulin-5蛋白表達(dá)在兩組之間的變化與Fibulin-5 mRNA的變化趨勢(shì)較為一致,觀察組患者血清Fibulin-5水平為(44.8±12.0)μg/L，對(duì)照組為(110.2±40.2)μg/L，觀察組Fibulin-5水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4討論

4.1盆腔器官脫垂的發(fā)病機(jī)制盆底功能障礙性疾病是絕經(jīng)后婦女的常見(jiàn)病、多發(fā)病，主要病理改變?yōu)榻M織結(jié)構(gòu)和功能的缺陷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。關(guān)于盆腔臟器的研究諸多，多認(rèn)為其致病是多因素作用于盆腔臟器結(jié)締組織，導(dǎo)致結(jié)締組織發(fā)生質(zhì)和量上的改變，從而不能發(fā)揮支持的作用，引起盆腔臟器脫垂。早在1990年就有學(xué)者提出了“盆底整體”的理論，將盆底的結(jié)締組織針對(duì)性地分為上中下三個(gè)水平：上段為主骸韌帶復(fù)合體；中段主要是陰道的側(cè)方支持，盆腔筋膜鍵弓及陰道直腸筋膜；下段為陰道的遠(yuǎn)端支持，包括會(huì)陰體和會(huì)陰隔膜。此三個(gè)水平結(jié)締組織的任何一方發(fā)生結(jié)構(gòu)改變及功能障礙，都可能導(dǎo)致盆腔器官脫垂的發(fā)生[3]。

細(xì)胞外基質(zhì)主要包括膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖以及糖蛋白，是盆底支持組織的重要組成部分之一。任何一種成分的結(jié)構(gòu)或含量的變化，都可能降低盆底組織彈性，降低其抗張能力，削弱細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)盆底的支持作用，進(jìn)而引起盆腔臟器脫垂。細(xì)胞外基質(zhì)的多種成分中，彈性蛋白是重要成分之一，其主要由彈性軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞分泌。彈性蛋白是以彈性蛋白原的形式被分泌，在細(xì)胞外靠近質(zhì)膜處發(fā)生交聯(lián)，形成疏松的富于彈性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即彈性纖維。彈性蛋白需要交聯(lián)形成彈性纖維后，才能發(fā)揮其相應(yīng)的功能[4]。彈性蛋白構(gòu)成彈性纖維的中心，在蛋白外圍由微纖維原包繞，可以調(diào)節(jié)彈性蛋白分子組裝成彈性纖維。彈性纖維大量存在于女性生殖器官，一般狀態(tài)下其代謝緩慢，而在妊娠期以及分娩后會(huì)大量重塑。一旦妊娠期或分娩時(shí)，生殖道組織彈性纖維降解之后不能很好重塑，就易破壞彈性纖維的結(jié)構(gòu)，不能發(fā)揮支持的作用，引起生殖道組織結(jié)構(gòu)功能的缺陷。彈性纖維的良好功能，在產(chǎn)后盆腔臟器的復(fù)舊中意義重大。

4.2Fibulin-5的結(jié)構(gòu)與特性Fibulin家族是一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族，有證據(jù)表明，F(xiàn)ibulins家族是蛋白質(zhì)中的一個(gè)古老家族。早在原蟲(chóng)時(shí)期，就存在Fibulin家族，直到人類(lèi)物種的形成，F(xiàn)ibulin家族一直高度保守。Fibulin家族主要包括兩個(gè)亞群，第一個(gè)亞群主要有Fibulin-1、Fibulin-2以及Fibulin-6，第二個(gè)亞群主要有Fibulin-3、Fibulin-4、Fibulin-5以及Fibulin-7，其中第二個(gè)亞群因蛋白鏈較短，又稱(chēng)短小Fibulin。

Fibulin-5是細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白，共有448個(gè)氨基酸，位于14q32，在機(jī)體富含彈性蛋白的組織中廣泛分布[5]。Fibulin-5的C末端含有6個(gè)cb EGF-like區(qū)域，在細(xì)胞外與鈣離子結(jié)合，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞吸附，并結(jié)合細(xì)胞表面的整合素等，進(jìn)而與原彈性蛋白結(jié)合，將原彈性蛋白整合到細(xì)胞表面，促進(jìn)彈性纖維的形成。Fibulin-5促使原彈性蛋白附著并定向排列于細(xì)胞表面，通過(guò)類(lèi)賴(lài)氨酞氧化酶-1 (LOXL-1)的催化，氧化脫氨基作用使得彈性蛋白中賴(lài)氨酸或輕賴(lài)氨酸氧化成醛基賴(lài)氨酸，而后合成高度穩(wěn)定的共價(jià)交聯(lián)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)彈性纖維的組裝。因此，在彈性蛋白聚合過(guò)程中，F(xiàn)ibulin-5作為彈性蛋白交聯(lián)排列支架使LOXL-1集中在纖維集合位點(diǎn)從而生成彈性蛋白共價(jià)交聯(lián)。正是因?yàn)閺椥缘鞍字懈缓朔N交聯(lián)，各個(gè)原彈性蛋白分子間的相對(duì)位置較為穩(wěn)固，給予外力時(shí)雖可暫時(shí)移位，一旦去除外力，即回復(fù)到原來(lái)構(gòu)型，成為彈性纖維富于彈性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[6]。

4.3Fibulin-5與盆腔器官脫垂的相關(guān)性盆腔臟器的支持主要依靠盆底結(jié)締組織，其中彈性纖維發(fā)揮重要作用。彈性纖維在女性生殖器官中含量豐富，具有較強(qiáng)的膨脹及伸展能力。一般情況下，妊娠三個(gè)月的胎兒即產(chǎn)生彈性纖維。有學(xué)者研究小鼠真皮時(shí)發(fā)現(xiàn)，小鼠出生時(shí)高表達(dá)Fibulin-5、彈性蛋白原等，隨后逐漸減少至一個(gè)較少的水平。在成人組織中正常生理?xiàng)l件下，彈性纖維的代謝較緩慢，在整個(gè)生命周期都是比較穩(wěn)定地存在[7]。正常絕經(jīng)后婦女的子宮主韌帶組織中彈性纖維是完整沒(méi)有損傷的，而盆腔器官脫垂患者的彈性蛋白受損甚至缺失，考慮盆腔器官脫垂患者在產(chǎn)后彈性蛋白合成減少，進(jìn)而削弱了盆底結(jié)締組織的彈性機(jī)能，進(jìn)而促進(jìn)了盆腔器官脫垂的發(fā)生[4]。有研究Fibulin-5基因缺失的小鼠全身的彈性纖維均嚴(yán)重異常，部分小鼠能成活到成年，但其大動(dòng)脈缺乏順應(yīng)性，且皮膚松弛并患有嚴(yán)重肺氣腫，進(jìn)一步研究斷裂的彈性蛋白片段，提示彈性蛋白酶活性未發(fā)生改變即彈性纖維分解未增加，而是彈性纖維合成缺陷。Fibulin-5是彈性纖維組裝過(guò)程中的重要結(jié)合蛋白，能促進(jìn)原彈性蛋白的交聯(lián)，進(jìn)而形成彈性纖維[8]。上文中所說(shuō)的Fibulin-5基因缺失的小鼠有類(lèi)似于盆腔臟器脫垂的表現(xiàn)，即說(shuō)明在盆腔支持組織功能中彈性纖維的合成與組裝是關(guān)鍵。彈性纖維動(dòng)態(tài)平衡的破壞，可能直接導(dǎo)致盆腔臟器脫垂的發(fā)生。

本文通過(guò)比較盆腔器官脫垂患者與無(wú)盆底功能障礙性疾病的患者主韌帶組織中的Fibulin-5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在盆腔器官脫垂患者主韌帶組織中Fibulin-5的表達(dá)量明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了Fibulin-5表達(dá)的降低可導(dǎo)致彈性蛋白合成障礙，無(wú)法形成穩(wěn)定的彈性纖維或彈性纖維合成減少,盆底支持組織中細(xì)胞外基質(zhì)彈性能力下降，導(dǎo)致盆腔器官脫垂的發(fā)生，說(shuō)明Fibulin-5與盆腔臟器脫垂發(fā)病的相關(guān)性。

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(編輯雅文)

摘要目的：研究Fibulin-5在盆腔器官脫垂患者主韌帶組織中的表達(dá)，分析其與盆腔器官脫垂程度之間的相關(guān)性。方法：選取我院婦科行子宮全切術(shù)的患者100例作為研究對(duì)象，根據(jù)手術(shù)病因不同分為觀察組和對(duì)照組，其中觀察組患者病因?yàn)榕枨黄鞴倜摯?，?duì)照組病因?yàn)闊o(wú)盆底功能障礙性疾病的婦科疾病，收集所選患者的主韌帶組織，采用實(shí)時(shí)定量PCR以及酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定Fibulin-5的表達(dá)，比較兩組患者Fibulin-5的表達(dá)情況并分析。結(jié)果：經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示觀察組患者的主韌帶組織中Fibulin-5 mRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，血清Fibulin-5水平亦明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：患者主韌帶組織中Fibulin-5表達(dá)的降低，可導(dǎo)致彈性蛋白合成障礙，無(wú)法形成穩(wěn)定的彈性纖維或彈性纖維合成減少,盆底支持組織中細(xì)胞外基質(zhì)彈性能力下降，與盆腔臟器脫垂發(fā)病有關(guān)。

關(guān)鍵詞Fibulin-5盆腔器官脫垂主韌帶組織

Expression of Fibulin-5 in Main Ligament of Pelvic Organ Prolapse

CHENG Xiaoyan,WU Honglian,LV Weichao,etal.LishuiPeople’sHospital,ZhejiangProvince323000

ABSTRACTObjective:To study the Fibulin-5 main ligament tissue of the patients with pelvic organ prolapse, analysis with the relationship between the degree of pelvic organ prolapse.Methods:Select our hospital department of gynaecology line of 100 patients with uterine full cut method as the research object,according to different operation causes are divided into observation group and control group,the observation group of patients disease because of pelvic organ prolapse, control group disease because of non pelvic floor functional disorder disease of department of gynaecology,collect the selected patients with main ligament tissue,using real-time quantitative PCR and enzyme linked immunosorbent assay Fibulin-5 expression, compared two groups of patients Fibulin-5 expression and analysis.Results:The results of after statistical analysis,according to observation group of patients with primary Fibulin-5 mRNA expression in ligament tissue significantly lower than the control group, the serum levels of Fibulin-5 is significantly lower than the control group, there were significant difference of statistically significant (P<0.05).Conclusion:The patients with primary Fibulin-5 expression in the tissues of the ligament is reduced,which can lead to elastic protein synthesis disorder, unable to form stable elastic fiber or synthetic elastic fibers decrease,flexibility of extracellular matrix in the supportive tissue of the pelvic floor ability to drop, associated with the onset of pelvic organ prolapse.

KEY WORDSFibulin-5,Pelvic organ prolapse,The main ligament tissue

收稿日期2015-06-19

中圖分類(lèi)號(hào)：R711.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7585(2015)21-2898-03

基金項(xiàng)目：2012年浙江省麗水市科技局課題(2012ZC040)