何　巖，　姚麗平，　李文超，　黃民生，　張一璠

(1. 華東師范大學(xué) 上海市城市化生態(tài)過(guò)程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上?！?00241；

2. 華東師范大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 上?！?00241)

黑臭河道底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)人工曝氣響應(yīng)的DGGE分析

何巖1,2，姚麗平1,2，李文超1,2，黃民生1,2，張一璠1,2

(1. 華東師范大學(xué) 上海市城市化生態(tài)過(guò)程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海200241；

2. 華東師范大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 上海200241)

摘要：采用基于16S rDNA的PCR-DGGE (變性梯度凝膠電泳) 圖譜并通過(guò)條帶割膠回收DNA 進(jìn)行序列分析，初步探討了不同曝氣條件下黑臭河道底泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及其變化，同時(shí)用冗余分析(RDA)研究了環(huán)境因子與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系. 結(jié)果表明，人工曝氣對(duì)黑臭河道底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響，并且隨不同曝氣強(qiáng)度底泥細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)不同的變化，其中當(dāng)曝氣擾動(dòng)雷諾數(shù)(Re)為1810，溶解氧(DO)為7.35時(shí)，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落多樣性最高；序列比對(duì)分析推測(cè)適度的曝氣有利于促進(jìn)碳、氮、硫循環(huán)相關(guān)細(xì)菌的生長(zhǎng)，其中以變形菌門為主導(dǎo)；冗余分析顯示DO和Re對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著.

關(guān)鍵詞：黑臭河道;底泥;曝氣;細(xì)菌;DGGE

第一作者：何巖，女，副教授，博士，研究方向?yàn)樗h(huán)境治理與修復(fù).E-mail: yhe@des.ecnu.edu.cn.

0引言

在外源污染有效控制后，底泥內(nèi)源釋放成為黑臭河道的重要污染源，其污染物的遷移轉(zhuǎn)化行為是一個(gè)涉及化學(xué)、生物、物理等多種因素的多相的復(fù)雜的生物地球化學(xué)過(guò)程，其中微生物在這個(gè)過(guò)程中承擔(dān)著重要角色[1]. 目前關(guān)于底泥污染物循環(huán)過(guò)程的微生物特性研究主要是針對(duì)海洋、河口海岸以及湖泊沉積物，對(duì)污染嚴(yán)重且受人為干擾頻繁的黑臭河道底泥的相關(guān)研究較少，已有的研究分別是采用稀釋平板法和最大或然數(shù)法研究河道底泥氮轉(zhuǎn)化的細(xì)菌群落結(jié)抅[2]，以及用PCR-DGGE和克隆文庫(kù)方法研究酸性河道厭氧底泥的微生物多樣性[3]，但對(duì)于曝氣修復(fù)條件下黑臭河道底泥細(xì)菌群落多樣性及變化還尚未見報(bào)道. 本研究采用基于16S rDNA的PCR-DGGE圖譜并結(jié)合條帶割膠回收DNA 進(jìn)行序列分析，初步探討不同曝氣條件下黑臭河道底泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及其變化，同時(shí)用冗余分析(RDA)研究了環(huán)境因子與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，為人工曝氣治理黑臭河道工程的優(yōu)化實(shí)施提供依據(jù).

1材料與方法

1.1　樣品來(lái)源

樣品取自于底泥曝氣修復(fù)模擬裝置，裝置內(nèi)鋪設(shè)底泥來(lái)自上海市普陀區(qū)一條重污染河道，通過(guò)調(diào)節(jié)曝氣裝置的轉(zhuǎn)速來(lái)設(shè)定不同曝氣強(qiáng)度的運(yùn)行工況，具體可參見文獻(xiàn)[4]中的報(bào)道. 不同曝氣強(qiáng)度下，對(duì)應(yīng)水體平均流速分別為0、0.247、0.288、0.320和0.372 m/s，雷諾數(shù)Re分別為0、1 311、1 810、2 133和1 736，DO分別為1.24、6.18、7.35、8.00和8.03 mg/L，分別記為Run0、Run1、Run2、Run3和Run4，其中Run0為對(duì)照組，無(wú)曝氣，分別在每個(gè)工況運(yùn)行初始(RunxS)和穩(wěn)定(RunxE)時(shí)各采1次泥樣(x代表不同工況)，裝入無(wú)菌袋，并置于-80 ℃保存至分析.

1.2　基因組總DNA提取

河道底泥微生物基因組總DNA的提取采用TENP buffer/PBS buffer-Bead beating OMEGA土壤樣品DNA抽提試劑盒(OMEGA 公司)組合方法，具體操作步驟參照徐歡[5]的方法，并將提取的基因組總DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè).

1.3　PCR擴(kuò)增

以提取的基因組總DNA為模板，采用細(xì)菌的通用引物對(duì)968F(5′-AAC GCG AAG AAC CTT AC-3′)/1401R(5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′)對(duì)16 S rDNA的V6—V8區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，片段大小約為435 bp[6]. PCR反應(yīng)體系為：PCR master mix 12.5 μL，正、反向引物各0.75 μL(濃度為10 μmol/L)，DNA模板 0.5 μL，適量的滅菌ddH2O補(bǔ)足到25μL；擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃∞. 將得到的PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè).

1.4　DGGE方法

基因組總DNA 16S rDNA V6—V8區(qū)擴(kuò)增片段通過(guò)DGGE (Bio-Rad) 分離來(lái)研究細(xì)菌群落. 聚丙烯酰胺的變性梯度范圍為40%～65% , DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量為200 ng. 電泳條件為150 V , 60 ℃，420 min. 電泳完畢后經(jīng)3*Gelred染色液染色45 min，用凝膠成像儀拍攝DGGE圖譜并切膠. 切下來(lái)的代表性的條帶加入30 μL 70%冷乙醇洗膠，把乙醇吸出并揮發(fā)干，然后加入25~30 μL超純水，于4 ℃下24 h后再次PCR，將得到的PCR產(chǎn)物送入生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序.

1.5　冗余分析

將DGGE圖譜經(jīng)Quantity One軟件分析后轉(zhuǎn)化所得的條帶信息矩陣，應(yīng)用CANOCO 4.5軟件進(jìn)行除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(Detrended Correspondence Analysis，DCA)，結(jié)果顯示可選用基于線性模型的冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)研究細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系，然后采用前向選擇(Forward Selection)，用蒙特卡羅置換檢驗(yàn)(Monte Carlo permutation，Number of permutation 499)逐步找出顯著影響(P<0.05)細(xì)菌群落變化的主要環(huán)境因子，再將生成的數(shù)據(jù)文件應(yīng)用CanoDraw做出排序圖.

2結(jié)果與討論

2.1　不同曝氣工況下細(xì)菌群落的多樣性

圖1為不同曝氣工況下運(yùn)行初期和穩(wěn)定期黑臭河道底泥細(xì)菌的DGGE圖譜. 由于樣品中含量不低于1%的菌群才能在DGGE圖譜中顯示出來(lái)[7]，因此DGGE圖譜中主要表達(dá)的是優(yōu)勢(shì)菌群信息. 通過(guò)Quantity One分析DGGE圖譜中每個(gè)樣品條帶的位置和亮度，將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字化信息，用于評(píng)定細(xì)菌群落的多樣性. 圖2為不同曝氣條件下運(yùn)行初期和穩(wěn)定期黑臭河道底泥細(xì)菌群落的Shannon多樣性指數(shù)，各樣品值處于2.66~3.19之間.

從圖2可知，Run0、Run1和Run4運(yùn)行穩(wěn)定均較初始值有所降低，而Run2和Run3運(yùn)行穩(wěn)定比初始值均有明顯提高，表明不同的曝氣強(qiáng)度對(duì)底泥中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群多樣性產(chǎn)生了不同的影響，其中當(dāng)曝氣強(qiáng)度Re為1810，對(duì)應(yīng)水體流速為0.288 m/s，DO為7.35 mg/L條件下，有利于提高黑臭河道底泥中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落多樣性，這與觀察到的最佳硝化-反硝化耦合性能相對(duì)應(yīng)[4].

注：RunxS，運(yùn)行初期；RunxE，穩(wěn)定期；x，不同曝氣工況；下同

圖2　基于不同曝氣工況運(yùn)行初期和穩(wěn)定期黑臭河道底泥細(xì)菌DGGE圖譜的Shannon指數(shù)

2.2　不同曝氣工況下細(xì)菌群落的變化

將DGGE圖譜中的主要條帶(B1—B12)割膠測(cè)序，得到的有效序列與Genbank中的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見表1. 不同曝氣工況下細(xì)菌16S rDNA的序列比對(duì)表明，黑臭河道底泥中細(xì)菌大部分相似序列是不可培養(yǎng)的(Uncultured)，并且以厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌群. 厚壁菌門中的芽孢桿菌屬(Bacillussp.)為好氧或兼性厭氧菌，對(duì)熱和化學(xué)物質(zhì)具有很強(qiáng)的抵抗力，并且在惡劣環(huán)境的長(zhǎng)期刺激下，易產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，會(huì)抑制其他類群的生長(zhǎng)[8]. 厚壁菌門中的動(dòng)性球菌屬(Planococcussp.和Planomicrobiumsp.)可以作為陸源污染的一種指示類群，應(yīng)用于近岸環(huán)境污染程度的監(jiān)測(cè)[9,10]. 本研究所用的底泥樣品來(lái)自重污染黑臭河道，符合Firmicutes的生長(zhǎng)環(huán)境，這是重污染河道底泥細(xì)菌群落人為干擾的選擇產(chǎn)物.

表1　基于細(xì)菌DGGE圖譜測(cè)序條帶的16S rDNA序列比對(duì)

通過(guò)對(duì)不同曝氣工況下細(xì)菌群落的變化分析發(fā)現(xiàn)，在無(wú)曝氣和低曝氣強(qiáng)度條件下，條帶B4和B5為優(yōu)勢(shì)條帶，二者所代表的序列分別與多出現(xiàn)在污染嚴(yán)重的環(huán)境中的Bacillussp. MB12和Planomicrobiumsp.(均屬于厚壁菌門)具有較高的相似性[11]，可據(jù)此分析該河道污染嚴(yán)重，對(duì)惡劣環(huán)境抵抗性較強(qiáng)的厚壁菌門含量較多. 隨著曝氣強(qiáng)度的增加，DO含量增加明顯，大大的加快了污染物的遷移轉(zhuǎn)化，厚壁菌門含量降低，變形菌門含量增加. 條帶B10在工況2、3和4中具有較高亮度，經(jīng)比對(duì)其與來(lái)自油砂尾礦池治理過(guò)程中參與碳和硫循環(huán)[12]的UnculturedGeobactersp.(屬于Deltaproteobacteria)具有較高的相似性. 條帶B12經(jīng)比對(duì)其與來(lái)自生物膜的UnculturedAlcaligenessp.(屬于Betaproteobacteria)具有較高的相似性，Betaproteobacteria是氮循環(huán)主要參與者，已有研究表明[4]Run2和Run3具有較高的氨氮和總氮去除率，推測(cè)該菌可能是底泥內(nèi)源氮轉(zhuǎn)化的主要參與者之一. 因此推斷認(rèn)為，適度的曝氣可促進(jìn)底泥中碳、氮和硫循環(huán)相關(guān)細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而有利于對(duì)底泥內(nèi)源碳、氮和硫的控釋. 后續(xù)有待通過(guò)相關(guān)功能基因的研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí).

2.3　細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子的冗余分析

表2為基于DGGE圖譜所得細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落與環(huán)境因子的冗余分析(RDA). 從表2可知，該排序圖的前兩個(gè)排序軸特征值分別為0.380和0.206，前兩個(gè)排序軸共同解釋了58.7%的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落變化和67.0%的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落—環(huán)境因子關(guān)系，物種與環(huán)境因子之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.928和0.982. 4個(gè)排序軸總共解釋了78.6%的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落變化和89.8%的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落—環(huán)境因子關(guān)系，說(shuō)明該排序軸能較好地反映細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落演替與環(huán)境因子的關(guān)系.

表2　不同工況下細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群演替的冗余分析(RDA)

3結(jié)論

底泥是河道污染物質(zhì)地球化學(xué)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)與界面，其中微生物在污染物轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著十分重要的作用. 本研究首次初步探討了不同曝氣條件下黑臭河道底泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及其變化，發(fā)現(xiàn)曝氣對(duì)底泥中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落多樣性產(chǎn)生重要的影響作用，其中DO和Re是影響黑臭河道底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素. 初步推斷適度的曝氣可促進(jìn)底泥中碳、氮和硫循環(huán)相關(guān)細(xì)菌的生長(zhǎng)，其中當(dāng)曝氣強(qiáng)度Re為1 810，對(duì)應(yīng)水體流速為0.288 m/s，DO為7.35 mg/L條件下，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落多樣性最高，并以變形菌門為主導(dǎo). 建議后續(xù)開展相關(guān)功能基因的研究為人工曝氣治理黑臭河道的優(yōu)化實(shí)施提供更有力的依據(jù).

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(責(zé)任編輯張晶)

Responses of bacterial community structure in malodorous river sediments to aeration by DGGE

HE Yan1,2,YAO Li-ping1,2,LI Wen-chao1,2,

HUANG Min-sheng1,2,ZHANG Yi-fan1,2

(1.ShanghaiKeyLabforUrbanEcologicalProcessesandEco-Restoration,EastChina

NormalUniversity,Shanghai200241,China;

2.SchoolofEcologicalandEnvironmentalSciences,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China)

Abstract:In this study, 16S rDNA based PCR amplification and denaturing gradientgel electrophoresis (PCR-DGGE) as well as sequence alignment from the excised DGGE bands were used to investigate the bacterial diversity and variation. In addition, the redundancy analysis was adopted to assess the relationship between bacterial community structure and environmental factors. The results showed that aeration had marked effects on bacterial community structure in malodorous river sediments and different aeration intensities resulted in variable bacterial community. Amongst them the highest richness of bacterial community was observed with the aeration turbulence of Re=1 810 and DO of 7.35. It was also inferred that moderate aeration facilitated the growths of related bacteria to N- and S-cycling and theProteobacteria was dominant. It was also found that DO and Re played important roles in bacterial community from river sediments.

Key words:malodorous river;sediments;aeration;bacteria;DGGE

通信作者：黃民生，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樗h(huán)境治理與修復(fù)技術(shù)、廢水處理工藝與技術(shù)、環(huán)境微生物及應(yīng)用技術(shù). E-mail：mshuang@des.ecnu.edu.cn.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(41101471、51278192、41001347);上海市科委社會(huì)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(12231201900); 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助;國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2013ZX07310001、2014ZX07101012)

收稿日期：：2014-08

中圖分類號(hào)：X522

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1000-5641.2015.02.010

文章編號(hào)：1000-5641(2015)02-0084-07