李延武, 李卓成

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 廣東 深圳, 518035)

基因芯片技術(shù)在乙肝病毒分型和耐藥突變檢測(cè)中的應(yīng)用

李延武, 李卓成

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 廣東 深圳, 518035)

摘要:目的探討基因芯片技術(shù)在乙肝病毒(HBV)分型和耐藥突變檢測(cè)中的應(yīng)用。方法采用基因芯片法檢測(cè)105例HBV病毒攜帶者血清標(biāo)本，觀察HBV基因分型特點(diǎn)及針對(duì)核苷酸類藥物的耐藥突變情況，并結(jié)合受試者熒光定量PCR病毒載量、血清HBV標(biāo)志物及病理檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果105例HBV病毒攜帶者C型63例(60.0%), B型、C型混合型16例(15.2%), B型26例(24.8%), 各基因型構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C型HBV-DNA載量對(duì)數(shù)值、HBeAg陽(yáng)性率與B型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。病理活檢結(jié)果顯示炎癥分期G3～G4期、纖維化分級(jí)S3～S4級(jí)C型乙肝病毒攜帶者所占比重高于B型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。共檢出耐藥突變28例(26.67%); 204I居多，占11.4%, 180M+204V+204I突變共7例，占6.67%。臨床耐藥種類表現(xiàn)為拉米夫定耐藥26例，阿德福韋耐藥2例。結(jié)論基因芯片技術(shù)對(duì)乙肝病毒分型及耐藥突變檢測(cè)具有重要的作用。

關(guān)鍵詞:乙型肝炎病毒; 基因芯片; 基因分型; 耐藥突變

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球性流行，中國(guó)為乙型肝炎的重要疫區(qū)，HBV病毒攜帶者約占中國(guó)總?cè)丝诘?%～20%, 每年因慢性乙型肝炎導(dǎo)致的肝硬化、肝癌而死亡的人數(shù)將近30萬(wàn)[1]。HBV病毒根據(jù)全基因序列同源性大于92%及S基因系列同源性大于96%分為8種基因型，各基因型的地理、種族分布及耐藥特點(diǎn)均有不同，并直接影響到疾病的臨床表現(xiàn)及治療效果。作者應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)105例HBV病毒攜帶者進(jìn)行了檢測(cè)，旨在研究本院乙肝病毒基因分型特點(diǎn)及針對(duì)核苷酸類藥物耐藥突變情況，為乙型肝炎的防治提供臨床研究資料。

1資料與方法

1.1　研究對(duì)象

選取2012年1月—2014年1月本院傳染科收治的HBV病毒攜帶者105例為研究對(duì)象，所有患者均簽署知情同意書，其中男64例，女41例，年齡28～46歲。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 所有研究對(duì)象乙肝表面抗原(HBsAg)與HBV-DNA檢測(cè)均為陽(yáng)性結(jié)果; ② 均進(jìn)行肝組織病理活檢。研究對(duì)象的選擇注意排除除乙型肝炎病毒外其他型別肝炎病毒感染患者，并排除免疫性肝病，膽汁型肝硬化患者。

1.2　研究方法

對(duì)105例HBV病毒攜帶者清晨空腹取血4 mL于含促凝劑試管各3支，分別進(jìn)行基因芯片法檢測(cè)HBV基因分型(A-H)及耐藥突變(184G、181V、236T、194T、180M、204V、204I、202G、250V)；熒光定量PCR檢測(cè)HBV病毒DNA載量；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)乙肝血清標(biāo)志物；并對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行肝組織病理活檢，研究HBV基因分型(A-H)與HBV病毒DNA載量、乙肝e抗原(HBeAg)陽(yáng)性情況及肝組織病理活檢肝組織炎性分級(jí)(G0～G4)、肝纖維化(S0～S4)之間關(guān)系，并觀察105例乙肝病毒攜帶者HBV病毒耐藥突變情況。

1.3　實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.3.1基因芯片:HBV基因分型及耐藥突變檢測(cè)試劑采用珠海賽樂(lè)奇生物有限公司生產(chǎn)產(chǎn)品，全自動(dòng)基因擴(kuò)增儀為ABI7300，分子雜交儀為FYY-3型，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明操作，擴(kuò)增循環(huán)條件95 ℃10 min→94 ℃30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s(50個(gè)循環(huán))。

1.3.2熒光定量PCR: HBV病毒DNA載量檢測(cè)采用熒光定量PCR方法，試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，全自動(dòng)基因擴(kuò)增儀為ABI7500, 擴(kuò)增循環(huán)條件: 93 ℃ 2 min→93 ℃ 45 s, 55 ℃ 60 s(10個(gè)循環(huán))→93 ℃ 30 s, 55 ℃ 45 s(30個(gè)循環(huán))，分析后擴(kuò)增曲線調(diào)節(jié)Baseline的start值、end值以及threshod，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)定量，對(duì)于CT值處于27-30的灰值區(qū)域標(biāo)本，進(jìn)行重新取血復(fù)查。

1.3.3HBV血清標(biāo)志物:ELISA檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物，試劑使用萬(wàn)泰生物有限公司產(chǎn)品，全自動(dòng)免疫分析儀為深圳愛(ài)康醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的URANUS120，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書操作。

1.4　病理檢查

由相關(guān)臨床高資歷醫(yī)生超聲引導(dǎo)行肝組織取材，送病理活檢，肝組織炎癥分級(jí)及纖維化分期參照《病毒性肝炎防治方案》[2]的相關(guān)診斷。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間均值比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，構(gòu)成比、構(gòu)成率比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　105例HBV病毒攜帶者基因分型情況

105例HBV病毒攜帶者基因芯片檢測(cè)基因分型: C型63例(60.0%), B型、C型混合型16例(15.2%),B型26例(24.8%), 各不同基因型構(gòu)成比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.54，P=0.000), 其中以C型為主要型別。

2.2　不同基因型別HBV病毒攜帶者HBV-DNA根據(jù)不同基因型分組比較各組HBV病比較

根據(jù)不同基因型分組比較各組HBV病毒攜帶者HBV-DNA載量對(duì)數(shù)值、HBeAg陽(yáng)性率及病理活檢，HBV-DNA載量對(duì)數(shù)值3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), SNK兩兩比較3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 其中以C型HBV-DNA載量對(duì)數(shù)值較高; HBeAg陽(yáng)性率3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 兩兩比較C型HBeAg陽(yáng)性率與B型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他各組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。病理活檢經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析比較，炎癥分期、纖維化分級(jí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 炎癥分期G3～G4期，纖維化分級(jí)S3～S4級(jí)C型乙肝病毒攜帶者所占比重高于B型及B、C混合型。見(jiàn)表1。

2.3　105例HBV病毒攜帶者針對(duì)核苷酸類藥物耐藥突變檢測(cè)情況

105例HBV病毒攜帶者針對(duì)核苷酸類藥物耐藥突變基因芯片檢測(cè)情況見(jiàn)表2, 其中共檢出耐藥突變28例，占26.67%; 204I居多占11.4%, 180M+204V+204I突變居第2位，共7例，占6.67%; 臨床耐藥種類表現(xiàn)為拉米夫定耐藥26例，阿德福韋耐藥2例。

表1　不同基因型別HBV病毒攜帶者HBV-DNA載量對(duì)數(shù)值、

與C型比較，*P<0.05; 與B+C型比較，#P<0.05。

表2　105例HBV病毒攜帶者針對(duì)核苷酸類藥物耐藥

3討論

HBV基因型別的多態(tài)性源于其逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶校正功能的缺失，基因序列以點(diǎn)突變多見(jiàn)[3], 包括自然變異、抗病毒藥物以及機(jī)體免疫應(yīng)答導(dǎo)致的變異，變異長(zhǎng)期累積形成HBV病毒基因序列的差異性，也是病毒變異進(jìn)化的一種形式，目前根據(jù)基因序列差異性(全基因序列≥8%、S基因系列≥4%)分為常見(jiàn)的8種基因型(A-H), 各基因型又可分為不同亞型，中國(guó)以B、C、D這4種型別多見(jiàn)。各型別地域差異性較大, B型南方多見(jiàn)，而北方則以C型為主，本研究?jī)H檢測(cè)出B型、C型兩種型別，其中以C型為主占60.0%, B、C混合感染占15.2%, 符合上述觀點(diǎn)，混合型感染比率升高在其他研究中也有報(bào)導(dǎo)[4], 其因素考慮與人口流動(dòng)性有關(guān)。

病毒基因控制相關(guān)抗原的表達(dá)，基因不同的毒株有不同的抗原表達(dá)特點(diǎn)，病毒變異的結(jié)果也導(dǎo)致宿主免疫應(yīng)答以及患者臨床表現(xiàn)的多樣性，病情趨向于復(fù)雜化，也給臨床的治療提供了難度。相關(guān)研究[5]顯示, C型HBV病毒引起的肝損重于B型病毒，作者對(duì)研究中不同型別乙肝病毒攜帶者HBV-DNA病毒載量對(duì)數(shù)值以及HBeAg陽(yáng)性率進(jìn)行了比較，研究顯示C型HBV-DNA病毒載量對(duì)數(shù)值以及HBeAg陽(yáng)性率均高于B型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病例活檢結(jié)果顯示，C型肝組織炎癥分期以G3～G4居多，與B型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，纖維化分級(jí)以S3～S4居多，與其他2組均有顯著差異。數(shù)據(jù)說(shuō)明在重型肝炎及肝纖維化程度較高患者中，C型占較大比重。有學(xué)者[6]認(rèn)為C型HBV病毒較難清除，易形成持續(xù)的病毒血癥，預(yù)后較差。

乙肝的治療目前采用核苷類藥物及干擾素治療較為多見(jiàn)，常見(jiàn)核苷類藥物包括拉米夫定及阿德福韋脂，核苷類藥物對(duì)延緩肝炎病情進(jìn)展及改善組織學(xué)病變有良好的治療效果，但長(zhǎng)期治療過(guò)程中易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象為其共同的局限性[7-9]。本研究中耐藥突變率為26.67%, 突變類型以204I、180M+204V+204I、180M+204V多見(jiàn)，臨床表現(xiàn)為拉米夫定耐藥，204I、204V均位于聚合酶C區(qū)，這一區(qū)域?yàn)槔追蚨ǖ淖饔冒悬c(diǎn)，HBV野生型為蛋氨酸(M)，突變株被異亮氨酸(I)及纈氨酸(V), 其點(diǎn)突變分別為739位堿基鳥(niǎo)嘌呤(G)取代腺嘌呤(A)及741位堿基胸腺嘧啶(T)取代鳥(niǎo)嘌呤(G), 異亮氨酸及纈氨酸取代蛋氨酸誘發(fā)拉米夫定耐藥。資料[10-11]顯示，拉米夫定為耐藥率較高的核苷類藥物，且用藥時(shí)間越長(zhǎng)，耐藥率越高，用藥4年的耐藥率可達(dá)66%; 另阿德福韋脂臨床報(bào)導(dǎo)耐藥率較低，對(duì)于e抗原陽(yáng)性患者三年的耐藥僅為3.1%[12], 但本研究中發(fā)現(xiàn)2例，值得引起臨床的關(guān)注。

基因芯片為采用光導(dǎo)原位合成及顯微印刷將大量特定序列探針固密集有序的固定與載體上，通過(guò)多元雜交進(jìn)行定性及定量的方法，微型化、集成化、高通量，平行化及敏感性強(qiáng)為其主要特點(diǎn)[13-14], 可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因改變?；蛐酒瑢?duì)乙肝病毒分型及耐藥突變檢測(cè)在乙肝防治上有重要的臨床意義，值得推廣應(yīng)用。

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Application of gene chip technology in hepatitis B

virus genotyping and detection of resistance mutations

LI Yanwu, LI Zhuocheng

(DepartmentofLaboratory,ShenzhenSecondPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong, 518035)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the application of gene chip technology in hepatitis B virus (HBV) genotyping and detection of resistance mutations. MethodsA total of 105 serum samples of patients with HBV were detected by gene chip method. Feature of HBV genotyping and drug resistance to the nucleotide drugs were observed and analyzed in the condition of considering with the subjects quantitative PCR viral load, serum HBV markers and pathological test results. ResultsOf 105 patients with HBV virus, 63 cases were type C (60.0%), 16 cases were mixed type of B and C (15.2%), 26 cases were type B (24.8%), and there were significant differences among all the genotypes (P<0.05). There were significant differences in HBV-DNA load logarithm and positive rate of HBeAg between type B and type C (P<0.05). Biopsy result revealed that ratio of type C patients with staging G3～G4and fiber S3～S4class of HBV was significantly higher than that of type B patients (P<0.05). Resistance mutations were detected in 28 cases (26.67%). 204I mutation was the most, accounted for 11.4%. 180M +204 V +204 I mutation was observed in 7 cases (6.67%). Clinical manifestations of resistance to drug were lamivudine-resistant species in 26 cases and adefovir resistance in 2 cases. ConclusionGene chip technology shows an important role in the HBV genotyping and detection of resistance mutations.

KEYWORDS:hepatitis B virus; gene chip; genotyping; resistance mutations

基金項(xiàng)目:廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201003037)

收稿日期:2014-12-09

中圖分類號(hào):R 512.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)09-049-03

DOI:10.7619/jcmp.201509014