溫淑平，　林強(qiáng)，　洪文榮

( 福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院, 福建 福州 350116 )

?

慶大霉素生物合成基因genB4的研究

溫淑平，林強(qiáng)，洪文榮*

( 福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院, 福建 福州 350116 )

摘要：以慶大霉素生物合成基因簇為模版，構(gòu)建了genB4基因阻斷質(zhì)粒pGB403.經(jīng)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入絳紅色小單孢菌G1008，得到一株genB4基因缺失工程菌GB4408.對(duì)菌株GB4408的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了TLC、HPLC和MS分析，結(jié)果表明GB4408不再合成慶大霉素C族組分，而是積累中間代謝產(chǎn)物G418、西索霉素和威大霉素，阻斷了從西索霉素到慶大霉素C1a的轉(zhuǎn)化以及從威大霉素到慶大霉素C2的轉(zhuǎn)化，這可能是genB4基因參與了慶大霉素絳紅糖胺C4′和C5′的雙脫氫作用.據(jù)此推論，在菌株GbK(△genK)基礎(chǔ)上敲除了genB4基因，并成功獲得一株主產(chǎn)西索霉素的工程菌GbKB4，進(jìn)一步驗(yàn)證了genB4的功能. 絳紅色小單孢菌；genB4； 西索霉素 Q93

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

慶大霉素是由小單孢菌發(fā)酵液中分離得到的一組廣譜抗生素，包含慶大霉素C1、C1a和C2等組分.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，慶大霉素由2-脫氧鏈霉胺(2-DOS)、絳紅糖胺和加洛糖胺3部分組成.研究[1-3]發(fā)現(xiàn)，慶大霉素的生物合成是從X2開始，分為2條路線(圖1)：一條經(jīng)JI-20A、西索霉素合成慶大霉素C1a；另一條經(jīng)G418、JI-20B、威大霉素合成慶大霉素C2，并最終合成慶大霉素C1.2條合成路線的酶促反應(yīng)只對(duì)絳紅糖胺進(jìn)行修飾.近年來，不同菌株的慶大霉素生物合成基因簇陸續(xù)被公布出來.F.Kudo等[1]通過與妥布霉素、卡那霉素生物合成基因簇比較，推測(cè)genB4為B型的氨基轉(zhuǎn)移酶基因.Guo J.H.等[4]通過基因失活研究，推測(cè)基因genB4與絳紅糖胺C3′,4′-雙脫羥基有關(guān).本實(shí)驗(yàn)組[5]也對(duì)genB4基因進(jìn)行了失活，結(jié)果產(chǎn)生了帶有新化合物的復(fù)雜組分的產(chǎn)物，但是否由genB4單基因失活而導(dǎo)致這一結(jié)果仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證；因此，有必要重新對(duì)genB4基因進(jìn)行敲除.

本文通過基因框內(nèi)敲除方法，重新設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建同源重組質(zhì)粒，阻斷絳紅小單孢菌G1008中g(shù)enB4(1 338 bp)的表達(dá)，并借助分析代謝物的變化，進(jìn)一步研究genB4基因在慶大霉素生物合成過程中所起到的作用.

圖1　慶大霉素生物合成途徑

1材料與方法

1.1　材料

1) 質(zhì)粒與菌株.克隆載體使用pMD19-T(日本TaKaRa)，用溫敏型自殺質(zhì)粒pKC1139[6]作為大腸桿菌-鏈霉菌屬間穿梭載體.用E.coliTop10

作為質(zhì)?？寺∷拗骶?，用短小芽孢桿菌〔CMCC(B) 63202〕作為抗生素微生物檢定菌，用E.coliET12567(pUZ8002)[7]作為大腸桿菌—鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移供體菌，用絳紅色小單孢菌G1008和GbK(△genK)作為接合轉(zhuǎn)移受體菌.

2) 培養(yǎng)基與抗生素.絳紅色小單孢菌斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基以及孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[8].抗生素微生物檢定培養(yǎng)基Ⅰ參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》，大腸桿菌培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基根據(jù)需要添加相應(yīng)的抗生素.本研究使用的抗生素作用濃度分別為：氨芐青霉素100 μg/mL，安普霉素50 μg/mL，氯霉素25 μg/mL，卡那霉素25 μg/mL，萘啶酮酸25 μg/mL.

3) 工具酶與試劑.限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、Taq DNA聚合酶、DNA Marker和Proteinase K(日本TaKaRa公司)；DNA凝膠回收試劑盒、RNase A酶和溶菌酶(上海生工生物工程有限公司)；其他常規(guī)試劑見參考文獻(xiàn)[9].

1.2　方法

1)引物設(shè)計(jì).以基因庫(Genebank)公布的慶大霉素生物合成基因簇(登錄號(hào)：JQ975418)為模板，利用生物信息學(xué)軟件Vector NTI11.5設(shè)計(jì)兩對(duì)引物擴(kuò)增genB4基因上下游序列作為同源交換臂：引物P1/P2用于擴(kuò)增上游交換臂B41，引物P3/P4用于擴(kuò)增下游交換臂B42.設(shè)計(jì)引物P5/P6用于genB4基因阻斷突變株的驗(yàn)證.所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物位置與擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如圖3所示，引物序列及其限制性酶切位點(diǎn)見表1.

2) DNA分子操作.PCR、質(zhì)粒DNA抽提、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、酶切、酶連和轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子克隆操作參照文獻(xiàn)[10].絳紅色小單孢菌基因組DNA的提取和接合轉(zhuǎn)移參照文獻(xiàn)[11].

表1　研究genB4所用引物

3)工程菌發(fā)酵及產(chǎn)物提取分析.絳紅色小單孢菌發(fā)酵及產(chǎn)物提取方法參照文獻(xiàn)[8]，生物效價(jià)測(cè)定參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》.提取的產(chǎn)品采用硅膠GF254薄層層析(TLC)和HPLC進(jìn)行初步檢測(cè)，TLC展開劑為氯仿-甲醇-氨水(1∶1∶1，體積比),混合均勻后靜置5 min，展開；HPLC參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》,組分的精確測(cè)定采用質(zhì)譜法.

2結(jié)果與討論

2.1　重組質(zhì)粒pGB403的構(gòu)建

提取絳紅色小單孢菌G1008基因組DNA，并以其為模板，PCR擴(kuò)增genB4上下游交換臂B41和B42.將這兩條交換臂分別克隆至pMD19-T載體，得到中間質(zhì)粒pGB401和pGB402.質(zhì)粒pGB401用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切，回收1 963 bp片段；質(zhì)粒pGB402用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切，回收2 019 bp片段；pKC1139用XbaⅠ和EcoRⅠ酶切，回收6 446 bp片段.將以上3個(gè)片段酶連，酶連樣轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆子，最終獲得重組質(zhì)粒pGB403.用EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)pGB403進(jìn)行酶切，酶切樣經(jīng)電泳檢測(cè)(圖2)有兩條帶與理論值(6 446 bp和3 994 bp)相符，最后通過測(cè)序驗(yàn)證，證明質(zhì)粒pGB403為正確質(zhì)粒.

2.2　GB4408菌株的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pGB403轉(zhuǎn)化E.coliET12567(pUZ8002)得到接合轉(zhuǎn)移供體菌E.coliET12567(pGB403/pUZ8002)，絳紅色小單孢菌G1008的孢子作為接合轉(zhuǎn)移受體菌.按照接合轉(zhuǎn)移方法，將孢子懸液與供體菌混合，稀釋涂布于平板培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)約20 h后，再用含安普霉素和萘啶酸的水溶液覆蓋，繼續(xù)培養(yǎng)直至在平板上長(zhǎng)出接合子.

圖2　質(zhì)粒pGB403酶切電泳檢測(cè)圖(1:PGB403,XbaⅠ/EcoRⅠ; 2:DL 5 000 Marker)

選取一株長(zhǎng)勢(shì)較好的接合子，提取基因組DNA，用P5/P6引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證.如果得到兩條片段，分別為1 241 bp和512 bp，那么說明其為單交換工程菌.PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與預(yù)期相符(圖3B)，這表明重組質(zhì)粒pGB403已成功整合到絳紅色小單孢菌G1008，即單交換突變株菌，將其命名為小單孢菌GB41.

由于單交換菌株具有同源性極高的片段，不穩(wěn)定，容易發(fā)生2次同源重組，獲得genB4基因缺失雙交換菌株或回復(fù)突變菌株，質(zhì)粒pGB403與G1008同源重組示意圖如圖3A所示.

1:DL 5 000 Marker; 2:G1008(P5/P6); 3:GB41(P5/P6); 4:GB4408(P5/P6)圖3　GB4408基因組DNA PCR產(chǎn)物電泳圖

將單交換菌株GB41于37 ℃、不含抗生素的斜面上松弛培養(yǎng)3代，然后分離單菌落，通過單菌落影印點(diǎn)板方法進(jìn)行篩選.經(jīng)篩選，從408株菌株中獲得2株在抗性平板上不生長(zhǎng)，而在無藥平板上正常生長(zhǎng)的單菌落.為驗(yàn)證其是否為目的工程菌，選取其中一株長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，提取其基因組DNA，然后利用雙交換鑒定引物P5/P6進(jìn)行PCR驗(yàn)證.如果電泳只檢測(cè)到512 bp的片段，而未檢測(cè)到1 241 bp的片段，那么該菌株即為雙交換工程菌.電泳檢測(cè)結(jié)果表明所挑選的菌株為雙交換工程菌，將其命名為GB4408，如圖3所示.將PCR產(chǎn)物測(cè)序后，其結(jié)果進(jìn)一步說明GB4408工程菌缺失了genB4基因729 bp.

2.3　GB4408菌株的代謝產(chǎn)物分析

GB4408的發(fā)酵液經(jīng)樹脂吸附、乙醇沉淀等處理之后，獲得粗制樣品.將樣品進(jìn)行TLC分析，結(jié)果如圖4.圖中主要有3個(gè)斑點(diǎn)，與標(biāo)準(zhǔn)品相比，未合成慶大霉素C1、C1a、C2等慶大霉素C族組分，轉(zhuǎn)而合成其他慶大霉素中間體.

TLC：1 G1008, 2 GB4408圖4　GB4408菌株代謝產(chǎn)物的TLC和HPLC分析

按照《中華人民共和國(guó)藥典》[12]，對(duì)GB4408代謝產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，檢測(cè)結(jié)果見圖4.慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品各組分的保留時(shí)間分別為：C1(5.98 min)，C1a(14.58 min)，C2a(18.57 min)，C2(21.05 min).GB4408的粗制樣品中的3個(gè)主峰，保留時(shí)間分別為7.68、18.72、20.12 min，這與慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間無一相符.由此進(jìn)一步表明GB4408的代謝產(chǎn)物沒有慶大霉素C族組分.

為精確確定GB4408代謝產(chǎn)物的組分，采用MS分析，結(jié)果如圖5所示.圖中主要離子峰有4個(gè)，分別為448.3(西索霉素)、462.3(威大霉素)、476.3(威大霉素C6′位甲基化產(chǎn)物)、497.3(G418).231.6和249.1分別為威大霉素和G418的雙電荷峰，322.2為碎片峰.這說明工程菌GB4408不再合成慶大霉素C族組分，而是積累中間代謝產(chǎn)物G418、西索霉素和威大霉素，阻斷了西索霉素到慶大霉素C1a和威大霉素到慶大霉素C2的轉(zhuǎn)化，據(jù)此推測(cè)genB4參與慶大霉素絳紅糖胺C4′和C5′的雙脫氫作用.

圖5　GB4408菌株代謝產(chǎn)物的MS分析

2.4　GbKB4工程菌的構(gòu)建

絳紅小單孢菌GbK菌高產(chǎn)慶大霉素C1a，且genK基因失活，阻斷了從慶大霉素X2至G418的轉(zhuǎn)化.根據(jù)對(duì)genB4基因功能的推測(cè)，若在菌株GbK上繼續(xù)敲除genB4基因，則有望獲得西索霉素的工程菌.

利用上述方法，將供體菌ET12567/(pGB403/ pUZ8002)與GbK(△genK)的孢子進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，7 d后長(zhǎng)出2株接合子，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的一株(命名為GbKB4-1).將其轉(zhuǎn)接至小單孢菌種子培養(yǎng)基，松弛培養(yǎng)4代后開始分離單菌落，并影印到含50 μ/mL安普霉素和不含抗生素的平板上，篩選后獲得工程菌GbKB4，提取其基因組DNA，用引物P5/P6進(jìn)行PCR驗(yàn)證，電泳檢測(cè)見圖6.

1: GB4408(P5/P6); 2: DL 5 000 Marker; 3: GbK(P5/P6)圖6　GbKB4基因組DNA PCR產(chǎn)物電泳圖

2.5　工程菌GbKB4發(fā)酵及代謝產(chǎn)物分析

按照同樣的方法，對(duì)工程菌GbKB4進(jìn)行發(fā)酵及代謝產(chǎn)物的提取，組分分析采用HPLC，見圖7.以西索霉素標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，按照慶大霉素的流動(dòng)相來分析，西索霉素標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時(shí)間為18.64 min.GbKB4粗制樣品有2個(gè)主峰，保留時(shí)間分別為6.21 min和18.63 min.其中后者與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間大致相符，由此初步確認(rèn)其為西索霉素.

圖7　GbKB4菌株代謝產(chǎn)物的HPLC分析

精確組分分析采用質(zhì)譜檢測(cè)，如圖8所示.GbKB4工程菌離子峰448[M+H]+、470[M+Na]+、486[M+K]+，它們與西索霉素分子量同質(zhì).離子峰483[M+H]+，它與中間代謝產(chǎn)物慶大霉素X2同質(zhì).242[M+H]+為慶大霉素X2雙電荷峰，其他峰為碎片峰或雜質(zhì)峰.這表明GbKB4菌株中敲除genB4基因，阻斷了西索霉素轉(zhuǎn)化慶大霉素C1a，由此獲得了一株主產(chǎn)西索霉素工程菌，同時(shí)也驗(yàn)證了genB4基因的功能.

圖8　GbKB4菌株代謝產(chǎn)物的MS分析

3結(jié)論

本文在絳紅色小單孢菌G1008中，對(duì)慶大霉素生物合成基因genB4進(jìn)行框內(nèi)敲除，獲得工程菌GB4408.對(duì)其代謝產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)其不再合成慶大霉素C組分，而是積累中間代謝產(chǎn)物G418、西索霉素和威大霉素.genB4基因的失活，阻斷了從西索霉素到慶大霉素C1a的轉(zhuǎn)化以及從威大霉素到慶大霉素C2的轉(zhuǎn)化，推測(cè)genB4基因參與了慶大霉素絳紅糖胺C4′和C5′的雙脫氫作用.由此推測(cè)，在genK基因阻斷工程菌GbK的基礎(chǔ)上敲除genB4基因后獲得genK和genB4雙基因失活的工程菌GbKB4.將GbKB4發(fā)酵后，提取其代謝產(chǎn)物，經(jīng)HPLC和MS分析結(jié)果表明，工程菌GbKB4主要積累中間體西索霉素和慶大霉素X2.與工程菌GB4408相比，工程菌GbKB4不再合成G418和威大霉素，因此本文成功地構(gòu)建了一株主產(chǎn)西索霉素的工程菌，同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了genB4基因的功能.

參考文獻(xiàn)：

[1]Kudo F, Eguchi. Biosynthetic genes for aminoglycoside Antibiotics[J]. The Journal of Antibiotics, 2009,62:471-481.

[2]UnwinJ,StandageS,AlexanderD,etal.GeneclusterinMicromonospra echinosporaATCC15835forthebiosynthesisofthegentamicinCComplex[J].TheJournalofAntibiotics, 2004,57(7):436-445.

[3]AboshanabK.Geneticstudiesonthebiosynthesisofthemajoraminoglycosideantibiotics.Dissertation[D].Wuppertal:BergischeWuppertalUniversity, 2005.

[4]GuoJH,HuangFL,HuangC,etal.Specificityandpromiscuityatthebranchpointingentamicinbiosynthesis[J].Chemistry&Biology, 2014,21:608-618.

[5]洪文榮,張熠,張書祖,等.慶大霉素生物合成基因研究進(jìn)展[C]//十二屆全國(guó)抗生素學(xué)術(shù)會(huì)議論文集.四川:中國(guó)抗生素雜志社,2013:452-466.

[6]FlettF,MersiniasV,SmithCP.HighefficiencyintergenericconjugaltransferofplasmidDNAfromEscherichiacolitomethylDNA-restrictingstreptomycetes [J].FEMSMicrobiologyLetters, 1997,155(2):223-229.

[7]ParanthamanS,DharmalingamK.IntergenericconjugationinStreptomyces peucetiusandStreptomycessp.strainC5:chromosomalintegrationandexpressionofrecombinantplasmidscarryingthechiCgene[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 2003,69(1):84-91.

[8]HongWR,YanLB.IdentificationofgntK,agenerequiredforthemethylationofpurpurosamineC-6′ingentamicinbiosynthesis[J].JournalofGeneralandAppliedMicrobiology, 2012,58(5):349-356.

[9]TobiasK,BibbM,MarkJB,etal.PracticalStreptomycesGenetics[M].Norwich:TheJohnInnesFoundation, 2000.

[10]BiermanM,LoganR,ObrienK,etal.PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichia colitoStreptomycesspp.[J].Gene, 1992,116(1):43-49.

[11]嚴(yán)凌斌,洪文榮,方志鍇,等.絳紅色小單孢菌G1008接合轉(zhuǎn)移體系的構(gòu)建[J].中國(guó)抗生素雜志,2011,36(12):899-904.

[12]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].2部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:976-977.

Research ofgenB4 in gentamicin biosynthesis gene cluster

WEN Shuping,LIN Qiang,HONG Wenrong*

(CollegeofBiologicalScienceandTechnology,FuzhouUniversity,Fuzhou350116,China)

Abstract：A recombinant plasmid pGB403 was constructed with gentamicin biosynthesis gene cluster as the template to study the function ofgenB4. Then, the plasmid pGB403 was transformed intoMicromonosporapurpureaG1008 by conjugation. A disruptgenB4 was obtained, i.e.,emqineeringstrain(GB4408). Its ferment extract was analysised by TLC, HPLC and MS. The GB4408 mainly produced accumulated intermediate G418, sisomicin and verdamycin instead of gentamicin C compounds. The metabolic flux from sisomicin to gentamicin C1a and from verdamycin to getamicin C2 were blocked. This result indicated thatgenB4 might be responsible for the dehydrogenation at C4′- C5′of purpurosamine. Based on the speculation,genB4 was distrupted in the strain GbK(△genK), and the strain GbKB4 mainly produced sisomicin was successful constructed, which further verified the function ofgenB4.

Key words：Micromonosporapurpurea;genB4; sisomicin

文章編號(hào)：1004-4353(2015)04-0313-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31070093)；國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2012ZX09201101-008)

收稿日期：2015-09-23*通信作者： 洪文榮(1956—)，男，博士，教授，研究方向?yàn)槲⑸镏扑?