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藍(lán)莓對(duì)酒精性脂肪肝小鼠肝組織HO-1表達(dá)及抗氧化能力的影響*

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-03-19網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.1006.020.html

黃超**， 任婷婷， 王豫萍， 程明亮***

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 感染科教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 研究藍(lán)莓對(duì)酒精性脂肪肝(AFLD)小鼠肝組織中血紅素氧化酶-1(HO-1)表達(dá)水平及抗氧化能力的影響，探討藍(lán)莓對(duì)AFLD的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法： 40只C57/6J小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、藍(lán)莓組、藍(lán)莓+HO-1抑制劑(鋅原卟啉，ZnPPIX)組及模型組，NIAAA法建立AFLD動(dòng)物模型，油紅O染色法檢測(cè)模型建立情況及各組小鼠肝組織病理學(xué)變化；取眼眶血檢測(cè)各組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，甘油三脂(TG)，膽固醇(TC)含量；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定各組小鼠肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量；Western blot法檢測(cè)各組小鼠肝組織中HO-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果： 藍(lán)莓組肝組織脂肪沉積較模型組及藍(lán)莓+ZnPPIX組明顯減少，血清中ALT、AST、TG及TC含量降低(P<0.05)，肝組織中SOD活性和GSH含量升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)；藍(lán)莓組HO-1蛋白表達(dá)量高于藍(lán)莓+ZnPPIX組及模型組。結(jié)論： 藍(lán)莓可減輕AFLD，其機(jī)制可能與上調(diào)小鼠肝臟HO-1的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]脂肪肝,酒精性； 藍(lán)莓； 氧化應(yīng)激； 血紅素氧化酶-1； 肝功能試驗(yàn)

乙醇代謝所引起的氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體損傷以及細(xì)胞防御體系的激活是酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)的主要發(fā)病機(jī)制，臨床上使用抗氧化劑治療AFLD具有較好的療效[1-5]。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)對(duì)多種氧化損傷有良好的保護(hù)作用，已成為目前研究預(yù)防氧化攻擊的首選靶基因之一。藍(lán)莓中富含的花青素、多酚類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物是果品中少有的特殊成分，具有明確的抗氧化活性，被稱(chēng)為果蔬中“第一號(hào)抗氧化劑”。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立AFLD動(dòng)物模型，以HO-1為研究重點(diǎn)，觀察在藍(lán)莓及HO-1抑制劑(ZnPPIX)干預(yù)下小鼠肝臟脂肪沉積、肝功能損傷指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)及HO-1蛋白表達(dá)的變化，探討藍(lán)莓對(duì)小鼠AFLD的干預(yù)作用及可能作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1　材料與儀器

藍(lán)莓(兔眼品種)產(chǎn)于麻江縣藍(lán)莓生產(chǎn)基地，-20 ℃保存，使用時(shí)臨時(shí)榨汁提取原漿使用；利伯DeCarli'82對(duì)照組飼料，利伯DeCarli'82損傷飼料(江蘇特洛菲飼料科技有限公司；F1259SP，F(xiàn)1258SP)；鋅原卟啉(ZnPPIX)溶液(Sigma公司)；谷胱甘肽(GSH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、丙二醛(MDA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海凱基)；HO-1兔抗鼠多克隆抗體一抗(ABCAM)，羊抗兔多克隆抗體二抗(上?；蚬こ?，GAPDH兔抗鼠抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑購(gòu)(Biomiga生物有限公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑(百樂(lè)公司)；顯微鏡圖像采集系統(tǒng)(OLYMPUS，BX41)，MSS全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(BioTec)，電泳儀(自北京市六一儀器廠，1DYCZ-24DN型)，高速低溫離心機(jī)(sigma3K15)；全自動(dòng)生化分析儀(日本ADVIA2400)，其他試劑均用分析純。

1.2　動(dòng)物分組建模

C57BL/6J雌鼠(購(gòu)于貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)40只，8~10周齡，體質(zhì)量(16±2)g；小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，隨機(jī)均分為對(duì)照組(A組)，藍(lán)莓組(B組)，藍(lán)莓+ZnPPIX組(C組)，模型組(D組)。參照NIAAA法，對(duì)照組飼喂DeCarli'82對(duì)照飼料，其余各組飼喂DeCarli'82損傷飼料，建立AFLD模型。各組小鼠均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)流程飼喂對(duì)應(yīng)的利伯DeCarli'82飼料10 d。B組在飼喂損傷飼料的同時(shí)進(jìn)行藍(lán)莓原漿灌胃(1.5 mL/100 g)；C組灌胃藍(lán)莓方法同B組，同時(shí)用ZnPPIX溶液(10 mg/kg)經(jīng)腹腔注射。

1.3　觀察指標(biāo)

造模10 d后，各組小鼠禁食水24 h，于處死動(dòng)物前9 h，A組灌胃精糊(灌胃量=體質(zhì)量×20 μL)，其余各組灌胃30%乙醇溶液(灌胃量=體質(zhì)量×20 μL)。9 h后各組小鼠麻醉脊柱脫頸處死，取眼眶血分離血清檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，甘油三脂(TG)，膽固醇(TC)檢測(cè)。取同部位肝臟部分肝組織置于液氮中行冰凍切片液中保存用于油紅O染色檢測(cè)肝組織脂肪化，其余肝組織放入凍存管后-80 ℃凍存，用于檢測(cè)下面兩類(lèi)指標(biāo)：(1)肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量，以空白組為參數(shù)調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算得出肝組織中相應(yīng)指標(biāo)。(2)肝組織HO-1蛋白表達(dá)，以GAPDH表達(dá)水平作為內(nèi)參照，蛋白的表達(dá)量以HO-1蛋白與內(nèi)參GAPDH對(duì)照蛋白灰度值的對(duì)比值表示。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　小鼠肝組織脂肪化程度鑒定

除A組外，B、C、D組油紅染色均可見(jiàn)細(xì)胞水腫及紅色脂滴，而B(niǎo)、C組肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴明顯少于D組，B組肝細(xì)胞水腫及脂滴沉積少于C組。

A為對(duì)照組，B為藍(lán)莓組，C為藍(lán)莓+ZnPPIX組，D為模型組圖1　各組小鼠肝組織油紅O染色(×200)Fig.1　Pathological changes of mice liver in each group detected by oil red O staining

2.2　血清ALT、AST、TG及TC

A、B及C組血清中ALT、AST、TG、TC含量低于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組ALT、AST、TG、TC含量明顯高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠血清ALT、AST、TG、TC水平

(1)與D組比較，P<0.05；(2)與B組比較，P<0.05；(3)與A組比較，P<0.05

2.3　肝組織中SOD、MDA、GSH

與D組比較，A、B、C組肝組織中SOD活性、GSH水平明顯增高，MDA水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C組SOD活性、GSH水平明顯降低，而MDA水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組小鼠肝組織中SOD活性、

(1)與D組比較，P<0.05；(2)與B組比較，P<0.05

2.4　肝組織中HO-1蛋白表達(dá)

B、D組HO-1蛋白表達(dá)高于A組和C組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； B組HO-1蛋白表達(dá)高于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

(1)與A組比較，P<0.05；(2)與C組比較，P<0.05；(3)與D組比較，P<0.05圖2　各組小鼠肝組織中HO-1蛋白的表達(dá)Fig.2　The levels of HO-1 in mice liver in each group

3討論

世界衛(wèi)生組織《2014年酒精與健康全球狀況報(bào)告》 顯示，2012年全球因有害食用酒精造成330萬(wàn)人死亡，超過(guò)艾滋病、肺結(jié)核、暴力事件死亡人數(shù)的總和，占全球死亡總數(shù)的5.9%，其中因酒精性肝病死亡的比例占1/2。而AFLD是酒精性肝病早期的病理改變，若能得到有效控制，將大大降低酒精性肝病的發(fā)生。乙醇在肝臟中被乙醇脫氫酶(ADH)、微粒體中的乙醇氧化系統(tǒng)(MEOS)以及過(guò)氧化物酶體中的過(guò)氧化氫酶分解為乙醛，而其代謝過(guò)程將使肝細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和氧自由基增多；當(dāng)生成的ROS和氧自由基超過(guò)SOD和GSH等抗氧化因子的清除能力時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化造成肝細(xì)胞線粒體功能紊亂，引起肝細(xì)胞脂肪變性，進(jìn)而發(fā)展為AFLD。HO-1是細(xì)胞微粒體酶，主要功能是降解血紅素生成膽綠素、CO及Fe2-，而膽綠素經(jīng)膽綠素還原酶的作用生成膽紅素，二者均具有抗氧化功能；Fe2-可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白的生成，減少自由態(tài)鐵的含量發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞效應(yīng)。另一方面HO-1產(chǎn)生的CO則通過(guò)抑制細(xì)胞色素P450 ZE1催化活性和激活生物信號(hào)傳導(dǎo)，減少細(xì)胞氧化毒性損傷[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，HO-1所主導(dǎo)的抗氧化機(jī)制與AFLD的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[11]。有報(bào)道稱(chēng)當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，HO-1可作為保護(hù)性蛋白表達(dá)增加[12]。

藍(lán)莓由于其強(qiáng)大的抗氧化活性，被WHO/FAD列為最佳的健康食品之一[13]。近年來(lái)藍(lán)莓明確的抗氧化、抗炎作用被應(yīng)用于各領(lǐng)域氧化損傷疾病的防治研究。本課題組在前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)了藍(lán)莓能夠通過(guò)提高機(jī)體的抗氧化能力對(duì)CCL4引起的急性肝損傷起到較好的保護(hù)作用[14]。推測(cè)藍(lán)莓拮抗AFLD的發(fā)生發(fā)展，機(jī)制可能與藍(lán)莓所含的活性物質(zhì)可調(diào)節(jié)肝臟中HO-1蛋白的表達(dá)并改善機(jī)體氧化應(yīng)激有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)NIAAA法成功復(fù)制了小鼠AFLD模型。通過(guò)對(duì)藍(lán)莓組及模型組小鼠油紅染色、肝功能指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓組小鼠肝組織脂肪沉積明顯少于模型組，血清ALT、AST、TG、TC明顯低于模型組(P<0.05)，提示藍(lán)莓能夠拮抗乙醇代謝引起的肝損傷，減少肝組織中脂肪的沉積。另一方面，藍(lán)莓組較模型組肝組織中MDA水平下降(P<0.05)、SOD活性及GSH水平增加(P<0.05)。而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，能夠反映肝組織由于氧自由基過(guò)量產(chǎn)生所導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷程度，肝組織中GSH和SOD的含量及活性能反映肝臟抗氧化應(yīng)激的水平。提示藍(lán)莓能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減少乙醇代謝引起的氧化應(yīng)激損傷。Western blot結(jié)果還顯示，模型組HO-1的蛋白表達(dá)高于正常組(P<0.05)，表明當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，HO-1會(huì)應(yīng)激性地表達(dá)上升；藍(lán)莓組HO-1表達(dá)高于模型組(P<0.05)，提示藍(lán)莓對(duì)AFLD的保護(hù)作用可能與上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化能力有關(guān)。本研究進(jìn)一步通過(guò)經(jīng)典HO-1抑制劑ZnPPIX+藍(lán)莓處理模型小鼠，在灌胃藍(lán)莓的同時(shí)抑制HO-1的表達(dá)，觀察此條件下小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積、生化指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示，藍(lán)莓+ZnPPIX組小鼠油紅染色脂肪沉淀、肝血清損傷指標(biāo)積及MDA含量明顯高于藍(lán)莓組(P<0.05)，而肝組織中HO-1蛋白的表達(dá)、SOD活性、GSH含量低于藍(lán)莓組(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了藍(lán)莓對(duì)AFLD的保護(hù)作用與肝組織內(nèi)HO-1的表達(dá)變化從而影響機(jī)體抗氧化能力與有關(guān)。

綜上所述，藍(lán)莓對(duì)AFLD具有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)，提高機(jī)體的抗氧化能力有關(guān)，而藍(lán)莓對(duì)AFLD保護(hù)作用的深入機(jī)制則有待進(jìn)一步的研究。

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(2015-01-04收稿，2015-02-17修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 周凌

The Influence of Blueberry on Heme Oxygenase-1 Expression and

Antioxidant Ability of Mice with Alcoholic Fatty Liver Disease

HUANG Chao, REN Tingting, WANG Yuping, CHENG Mingliang

(InstituteofInfectiousDiseases,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalcollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the influence of blueberry on heme oxygenase-1 (HO-1) and antioxidant ability of mice with alcoholic fatty liver disease (AFLD), and to explore the protective effects of blueberry on AFLD and possible mechanism. Methods: Forty C57/6J mice were randomly divided into control group,blueberry group,blueberry+ZnPPIX group and model group. AFLD model was established by using NIAAA method, pathological changes in the hepatic tissues were detected by oil red O staining, the orbital blood was taken to detect the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST)，triglyceride (TG) and total cholesterol (TC).The superoxide dismutase (SOD) activity and glutathione (GSH) levels, malondialdehyde (MDA)contents inliver tissue were quantified by ELISA.The expression of HO-1 in liver tissue was detected by Western blot. Results: Compared with model group and blueberry+ZnPPIX group, lipid accumulation in liver tissue of mice in blueberry group decreased, serum ALT, AST,TG and TC levels decreased (P<0.05).The hepatic MDA content also decreased (P<0.05), while GSH contents, SOD activity and the HO-1 levels increased (P<0.05). Conclusion: Blueberry can alleviate AFLD, the mechanism may relate to raise the expression of HO-1 in mice, increase the antioxidant capacity.

[Key words]fatty liver, alcoholic; blueberry; oxidative stress; heme oxygenase-1; liver function test

[中圖分類(lèi)號(hào)]R363.1； R575.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)03-0245-04

通信作者***E-mail:mlcheng@yeah.net.

[基金項(xiàng)目]**貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2012級(jí)碩士研究生