谷依露，高小峰，李仁輝

(1：中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢 430072)

(2：中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

(3：同濟大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092)

水華微囊藻(Microcystisflos-aquae)生長周期中腐殖酸的釋放特性*

谷依露1，2，高小峰3，李仁輝1**

(1：中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢 430072)

(2：中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

(3：同濟大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092)

摘要：由于嚴(yán)重的水體富營養(yǎng)化，太湖長期暴發(fā)藍藻水華，這些藍藻在代謝及消亡過程中大量釋放包括腐植酸在內(nèi)的有機物，不僅影響供水水質(zhì)，并且進一步加重了水華程度.以太湖水華優(yōu)勢藻種——水華微囊藻(Microcystis flos-aquae T34)為研究對象，對藻株生長周期中的藻細(xì)胞、浮游細(xì)菌進行計數(shù)，并使用TOC儀與三維熒光光譜對培養(yǎng)液中提取的腐殖酸進行定量與定性分析，探究水華微囊藻在生長過程中藻細(xì)胞密度、浮游細(xì)菌密度與腐殖酸濃度的變化規(guī)律.結(jié)果表明，培養(yǎng)液中腐殖酸濃度的變化趨勢與細(xì)菌數(shù)量變化趨勢一致，但與細(xì)菌數(shù)量曲線拐點相比，腐殖酸濃度曲線拐點出現(xiàn)兩周的延遲.腐殖酸產(chǎn)量在藻細(xì)胞對數(shù)期較低，當(dāng)水華微囊藻進入穩(wěn)定期與衰亡期后，腐殖酸大量產(chǎn)生，其濃度迅速增加，最高可達到28.6 mg/L.根據(jù)三維熒光光譜分析，水華微囊藻所產(chǎn)生的腐殖酸特征峰出現(xiàn)在(235~245 nm)/(380~425 nm)，屬于類富里酸熒光峰.本研究初步探究藍藻與水體腐殖酸之間的關(guān)系，為水體腐殖酸來源的研究提供了新的思路.

關(guān)鍵詞：水華微囊藻；腐殖酸；三維熒光光譜

*國家自然科學(xué)基金國際(地區(qū))合作交流項目(41130743)資助.2014-12-17收稿；2015-03-05收修改稿.谷依露(1990~)，女，碩士研究生；E-mail： guyilu.wuxi@gmail.com.

水體腐殖酸是一種水體污染物中間體，是一大類具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)的有機物總稱，其特點是極難降解，在自然界中的壽命可長達80年[1].腐殖酸在飲用水處理過程中易形成消毒副產(chǎn)物，從而影響飲用水的安全性，同時腐殖酸還是有色可溶性有機物(CDOM)的重要組成部分，在紫外和可見光波段有強烈的吸收作用，是湖泊水體中重要的發(fā)色物質(zhì)，影響水的色度[2].根據(jù)近年來的研究，腐殖酸在天然水體中一般濃度為10~20 mg/L，在湖泊表層水體中可溶性有機物(DOM)可占50%左右[3].水生生態(tài)系統(tǒng)中的腐殖酸在1930s末才被人們所認(rèn)知，直到1974年才首次將水體腐殖酸與陸地腐殖酸進行區(qū)分研究，水體腐殖酸對水生生態(tài)環(huán)境的影響也慢慢被人們所了解[4].雖然已有研究表明，腐殖酸的形成與生物活動密切相關(guān)，然而水體中的腐殖酸，特別是在藍藻水華的富營養(yǎng)化水體中的腐殖酸的來源和動態(tài)并不清楚，其與藍藻之間的關(guān)系有待研究[5].我國針對水體腐殖酸的研究鮮見報道，且提取手段以酸堿析出法為主.由于水體中的腐殖酸中含有富里酸，其疏水性較弱、親水性較強，因此酸堿析出法在提取過程中會造成較大的損耗.為此，國際腐殖酸協(xié)會規(guī)定了一種可以高效富集提取天然水體中腐殖酸的方法——大孔樹脂DAX-8富集法，其通過分子間的作用力，可以從水溶液中吸附腐殖酸，并可方便地洗脫再生，從而實現(xiàn)水體腐殖酸的富集、分離和回收[6].

在近十年間，由于較嚴(yán)重的水體富營養(yǎng)化，太湖每年頻繁發(fā)生藍藻水華.與其他湖泊相比，太湖藍藻水華具有周期長的特點，水華周期從5月持續(xù)至10月，橫跨春、夏、秋3個季度，并以微囊藻水華為主，微囊藻生物量可占藻類總生物量的50%~98%[7].微囊藻在生長過程中可以形成腐殖酸并向水體中釋放[6]，許多去除微囊藻水華的方法和技術(shù)也會導(dǎo)致腐殖酸在胞外大量釋放，而水體中的腐殖酸又能進一步加速微囊藻水華的形成[8].因此，為了能夠?qū)λw腐殖酸進行有效控制，有必要研究腐殖酸與微囊藻的關(guān)系，并研究其釋放特點.

以太湖常見的優(yōu)勢微囊藻——水華微囊藻(Microcystisflos-aquae)為材料，在實驗室模擬研究其生長過程中腐殖酸的動態(tài)變化，同時對培養(yǎng)過程中浮游細(xì)菌的變化進行觀察比較.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗中所使用的藻株為水華微囊藻(Microcystisflos-aquaeT34)，是從太湖中分離的單種藻株，保存于中國科學(xué)院水生生物研究所有害藻類學(xué)科組藻種庫.藻株保存在溫度為25±5℃、光照強度為25 μmol/(m2·s)、光暗周期為12h∶12h的條件下，所使用的培養(yǎng)基為CT完全培養(yǎng)基[9].

1.2 藻液的培養(yǎng)

在5L錐形瓶中加入3L滅菌CT培養(yǎng)基，接入水華微囊藻藻種，使微囊藻初始密度為5×106cells/L.培養(yǎng)條件為：溫度25℃、光照強度25 μmol/(m2·s)，光暗周期12 h∶12 h，并每日攪動3次[9].培養(yǎng)周期開始后，自第1d起，每隔一周取一定量的藻液，對其細(xì)胞數(shù)、細(xì)菌數(shù)及腐殖酸濃度進行測定分析.

1.3 藻細(xì)胞計數(shù)

藻細(xì)胞計數(shù)采用視野法[10].計數(shù)前充分?jǐn)噭蛟寮?xì)胞培養(yǎng)液，取0.1ml樣品注入浮游植物計數(shù)框內(nèi)，在400倍的Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡下計數(shù)100個視野，每個樣本重復(fù)計數(shù)2次.采用視野法計算細(xì)胞個體數(shù)后，原水樣中浮游植物數(shù)量的計算公式為：每升原水樣中浮游植物數(shù)量=計數(shù)所得浮游植物數(shù)目×計數(shù)框面積/(視野面積×取樣體積).

1.4 細(xì)菌計數(shù)

細(xì)菌計數(shù)采用Dapi染色法[11].取1ml攪拌均勻后的藻細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管，加入5 μl Dapi染料后，遮光染色10min.使用Millipore可拆卸式針筒過濾器將染好的藻液過濾至濾膜上，濾膜為Millipore過濾器配套黑膜，孔徑0.2μm配套.濾干后，將濾膜取出，展平至載玻片上，在濾膜中間滴加香柏油后蓋上蓋破片排除空氣.調(diào)處顯微鏡中與DAPI對應(yīng)的熒光光源后，即可在油鏡下觀察并拍照計數(shù).計算公式為：每毫升細(xì)菌總數(shù)=拍照面積細(xì)菌總數(shù)×濾膜有效過濾面積/(拍照面積×加樣體積).

1.5 腐殖酸的富集

腐植酸的提取采用國際腐植酸協(xié)會推薦的DAX-8大孔樹脂提取法[12-13].大孔樹脂經(jīng)溶脹漂洗去雜質(zhì)，再依次使用乙醇、乙腈、丙酮、甲醇在索氏提取器中分別提取4 h，樹脂用甲醇浸泡備用.取5ml經(jīng)純化過的樹脂裝入內(nèi)徑為1cm的層析柱中，通過恒流泵用蒸餾水洗樹脂至洗出液無甲醇味后，繼續(xù)用500ml 0.1mol/L NaOH溶液與500ml 1%HCl溶液交替洗樹脂，最后用蒸餾水沖洗樹脂至洗出液為中性.將40ml藻液用500℃灼燒后的玻璃纖維濾膜(孔徑0.2 μm)過濾，調(diào)節(jié)pH至2，以3ml/min的流量使其中20ml水樣通過樹脂柱，將濾液以及另外20ml沒有通過樹脂柱的水樣分別收集至灼燒后的TOC瓶中，使用TOC儀對其有機碳濃度進行測定.之后用30ml純乙醇以3ml/min的速度將富集在樹脂柱中的腐殖酸洗脫下來，使用平行蒸發(fā)儀蒸去乙醇后，用10ml去離子水重新溶解，以用于三維熒光光譜分析.本文中出現(xiàn)的腐殖酸濃度均以其有機碳濃度進行表證.計算公式為：腐殖酸有機碳濃度=未經(jīng)過樹脂柱富集的水樣的有機碳濃度-經(jīng)過樹脂柱富集的水樣的有機碳濃度.

1.6 三維熒光光譜分析

三維熒光光譜分析利用日本島津公司RF-5301PC熒光分光光度計及其配套的工作站軟件，配上1cm石英比色皿完成.儀器分析條件設(shè)定為：激發(fā)和發(fā)射狹縫為5 nm，掃描速度為12000 nm/min；激發(fā)波長的掃描范圍為200~450 nm，掃描間隔為5 nm；發(fā)射波長的掃描范圍為250~550 nm，掃描間隔為5 nm；每個樣平行測定3次，取平均值作為該樣品的熒光光譜[14].

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)過程中水華微囊藻細(xì)胞密度變化規(guī)律

培養(yǎng)條件下，水華微囊藻T34藻細(xì)胞密度的變化如圖1a所示.其中，第1~5周為對數(shù)生長期.藻細(xì)胞密度起始值為5×106cells/L，在第5周達到最高值2.64×108cells/L.第6周為穩(wěn)定期，藻細(xì)胞密度小幅度減少.第6~8周則為衰亡期，至第8周藻細(xì)胞密度為1.04×108cells/L(圖1a).

圖1 培養(yǎng)過程中水華微囊藻細(xì)胞密度(a)、細(xì)菌密度(b)和腐殖酸濃度(c)的動態(tài)變化Fig.1 Dynamics of M.flos-aquae cell density(a)， bacterial cell density(b) and humic acid concentration(c) during the cultivation

2.2 培養(yǎng)過程中細(xì)菌密度變化規(guī)律

在培養(yǎng)的前3周中，細(xì)菌密度增長較緩慢，第2周細(xì)菌密度增長至1.68×105cells/ml后在此水平上維持1周.第3周后之后細(xì)菌密度迅速增加，該迅速增長期從第3周持續(xù)到第6周，第4周細(xì)菌密度為第3周的2倍，至第6周細(xì)菌密度已達到9.23×105cells/L.第6~8周為穩(wěn)定期，細(xì)菌密度在此期間內(nèi)小幅度增長，第8周細(xì)菌密度為9.83×105cells/L.與圖1a對比可發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌對數(shù)期開始于第3周，即水華微囊藻對數(shù)期中期，當(dāng)水華微囊藻進入衰亡期時，該迅速增長期結(jié)束，之后進入緩慢增長的穩(wěn)定期(圖1b).

2.3 培養(yǎng)過程中腐殖酸濃度變化規(guī)律

藻細(xì)胞培養(yǎng)液中的腐殖酸濃度在第1周低于檢測閾值，第2~5周呈現(xiàn)小幅度增長趨勢，濃度自1.6 mg/L增加到5.4 mg/L；第5~8周，腐殖酸濃度增長幅度較大，第8周達到最大值，為28.6 mg/L.整個培養(yǎng)周期中，腐殖酸濃度的變化趨勢基本與細(xì)菌密度變化趨勢一致，但其緩慢增長期出現(xiàn)在第2~5周，與細(xì)菌密度相比延遲2周；當(dāng)水華微囊藻進入穩(wěn)定期與衰亡期后，腐殖酸濃度迅速增加(圖1c).

2.4 熒光光譜分析

利用三維熒光譜圖對洗脫下來的腐殖酸進行分析，可以獲得激發(fā)波長和發(fā)射波長同時變化下腐殖酸的完整信息.從獲得的三維熒光譜圖可以觀察到明顯的熒光峰A(235~245 nm)/(380~425 nm)(圖2)，屬于類富里酸熒光峰.

圖2 水華微囊藻培養(yǎng)液中腐殖酸三維熒光光譜Fig.2 3D EEM fluorescence spectrum of humic acid extrated from the M.flos-aquae cultures

3 討論

針對腐殖酸及其形成過程的研究大都集中在陸地高等生物上，水生系統(tǒng)中腐殖酸的形成依然是研究盲點.近10年來，大規(guī)模的藍藻水華在太湖頻繁暴發(fā)，而關(guān)于藍藻水華的發(fā)生發(fā)展過程特別是在秋季消亡過程中，對太湖這樣一個大型淡水富營養(yǎng)化湖泊所貢獻的腐殖酸還鮮有報道[15].由于腐殖酸的難降解性，它們能在水體中不斷累積，使可溶性有機物(DOM)含量不斷增高.同時由于腐殖酸特殊的化學(xué)性質(zhì)，能夠與水中營養(yǎng)元素結(jié)合，使之持續(xù)為藻類提供所需要的元素，進一步促進水華藍藻的生長[16-17].本研究結(jié)果顯示，水華微囊藻在生長后期釋放出大量的腐殖酸.結(jié)合葉琳琳等關(guān)于藻細(xì)胞裂解通常發(fā)生在水華后期并直接釋放大量的溶解性有機碳的結(jié)論[18]，我們更加確信藍藻水華在秋季消亡過程會導(dǎo)致腐殖酸的大量產(chǎn)生.

目前已知水體腐殖質(zhì)是一類多分散的、偶然性聚合的大分子有機物，來源于土壤腐殖質(zhì)、水生植物和低等浮游生物的分解產(chǎn)物經(jīng)過長期的物理、化學(xué)、生物作用而形成的復(fù)雜有機物.關(guān)于腐殖質(zhì)形成機理目前比較流行的假說有木質(zhì)素-蛋白質(zhì)復(fù)合體假說、微生物合成假說、植物和微生物細(xì)胞自溶假說、厭氧發(fā)酵形成腐殖質(zhì)三階段理論等[5].雖然上述理論仍不能系統(tǒng)、完善地解釋有機質(zhì)形成腐殖質(zhì)的生物化學(xué)過程，但都強調(diào)了微生物在這個過程中的重要作用[19].在本研究中，腐殖酸濃度的變化趨勢與細(xì)菌數(shù)量變化趨勢基本一致，并出現(xiàn)約2周的延遲效應(yīng)，顯示出在水生環(huán)境中，腐殖酸的生成與細(xì)菌的活動有密切聯(lián)系.值得注意的是，在第5周時，藻細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)菌密度已達到較高水平，然而腐殖酸在第5周之前只出現(xiàn)緩慢的增長.至水華微囊藻開始裂解、消亡，腐殖酸濃度才出現(xiàn)大幅度增加.這說明在培養(yǎng)過程中，腐殖酸主要來源于裂解的藻細(xì)胞.當(dāng)水華微囊藻細(xì)胞裂解后，其釋放的DOM以及細(xì)胞殘骸在細(xì)菌的作用下，一部分被細(xì)菌利用，另一部分則被轉(zhuǎn)化為腐殖酸，并不斷在溶液中積累，因而造成腐殖酸濃度不斷升高的趨勢.截止到第8周，腐殖酸濃度依然沒有減緩趨勢.因此，在藍藻水華的治理技術(shù)中，應(yīng)盡量選用避免藻細(xì)胞破裂的方法，以防止破裂的細(xì)胞持續(xù)釋放腐殖酸到水體中，造成水質(zhì)進一步惡化.

本研究采用目前國際上通用的分離和富集效果較好的DAX-8富集法來測定水華微囊藻培養(yǎng)液中的腐殖酸濃度，最高達28.6 mg/L，顯示該方法對水華藍藻腐殖酸研究的有效性.根據(jù)劉菲菲等對銅綠微囊藻胞外有機物釋放的研究，當(dāng)在25℃條件下培養(yǎng)至第50 d時，其細(xì)胞外的溶解性有機碳(DOC)濃度可達49.28 mg/L[20].鑒于本實驗的培養(yǎng)條件和以上研究相似，當(dāng)培養(yǎng)液中的腐殖酸濃度達到最高值時，胞外DOC濃度為59.66 mg/L.因此，推測微囊藻培養(yǎng)條件下腐殖酸濃度可占胞外DOC濃度的50%或以上，支持Kim等的觀點[3].

腐植酸作為一個多組分的復(fù)雜體系，傳統(tǒng)的熒光發(fā)射或激發(fā)光譜很難完整地描述該體系的熒光特征，也很難解決組分之間的干擾問題.由于腐植酸來源與提取方法不同，結(jié)構(gòu)上存在較大差異.紫外-可見光譜及紅外光譜可以在一定情況下分析腐植酸的結(jié)構(gòu)，但在區(qū)別不同來源腐植酸以及解釋其細(xì)微差別時存在一定的難度，用三維熒光光譜對提取的腐植酸進行表征則較為可行，其具有圖譜直觀、測定迅速、適用范圍較大的特點.由于水溶性的腐殖質(zhì)主要是腐殖酸和富里酸，一般文獻中所指的水體腐殖質(zhì)即腐殖酸、富里酸或兩者的混合物[21]，三維熒光光譜分析可以用來對混合物中的多種成分更好地加以分辨.本實驗中所提取得到的腐殖酸在三維熒光光譜分析中呈現(xiàn)出單一的熒光峰，屬于類富里酸，而類胡敏酸區(qū)未見明顯峰.熒光峰位置除了與離子強度、 腐殖化程度等因素有關(guān)外，還與有機物的組成和來源有關(guān)，不同來源與組成的有機物含有不同的熒光基團，會導(dǎo)致熒光峰位置存在差異[22].而在一些高等植物的研究中，已經(jīng)證明陸地植物葉部含有較多類腐殖酸物質(zhì)，其莖部則含有較多類富里酸物質(zhì)[18]，三維熒光光譜對于異質(zhì)性腐殖酸具有強大的甄別能力.因此，本實驗證明了來源于水華微囊藻的腐殖酸，其特征峰出現(xiàn)于(235~245 nm)/(380~425 nm)范圍內(nèi)，屬于類富里酸[23].張運林等[24]將太湖水樣中提取得到的腐殖酸進行三維熒光光譜分析，發(fā)現(xiàn)太湖水體中的腐殖酸出現(xiàn)2個較強的峰，分別為A峰(225 nm/410 nm)和B峰(330 nm/410 nm)，其中A峰與本實驗中所獲得的腐殖酸有相似的光譜學(xué)特征.而其他有關(guān)太湖DOM三維熒光分析中，該區(qū)域也通常有明顯的峰[25-26].有關(guān)不同水華藍藻種類的腐殖酸的類型和濃度，以及對富營養(yǎng)化水體中DOM的貢獻還有待用更多的水華藍藻藻種進行進一步擴展研究.

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?2015 byJournalofLakeSciences

Characterization of humic acid release during the growth ofMicrocystisflos-aquae

GU Yilu1，2， GAO Xiaofeng3& LI Renhui1

(1：InstituteofHydrobiology，ChineseAcademyofSciences，Wuhan430072，P.R.China)

(2：UniversityofChineseAcademyofSciences，Beijing100049，P.R.China)

(3：StateKeyLaboratoryofPollutionControlandResourceReuse，CollegeofEnvironmentalSciencesandEngineering,TongjiUniversity，Shanghai200092，P.R.China)

Abstract：Microcystis flos-aquae T34 strain， isolated from the dominant species of a water bloom in Lake Taihu， was cultivated to investigate its growth， along with bacterial growth in the culture and the release of humic acid. It was shown that the changing tendency of humic acid was similar to that of the bacteria， but the turning point of the former had two weeks’ delay compared with that of the latter. During the logarithmic phase of Microcystis flos-aqaue growth， the release of humic acid was relatively low， however the concentration of humic acid in the culture solution increased rapidly up to 28.6 mg/L. Based on the three dimensional EEM fluorescence spectrum analyses， the characteristic peak of humic acid from Microcystis flos-aquae T34 appeared as (235-245 nm)/(380-425 nm)， which is the typical fluorescence peak of a kind of fulvic acid. The result about the association between cyanobacteria and humic acid in this study will provide a new clue for the study of humic acid in aquatic ecosystems.

Keywords：Microcystis flos-aquae； humic acid； 3D-EEM fluorescence spectrum

通信作者**；E-mail：reli@ihb.ac.cn.

DOI10.18307/2015.0409